Optimierung der Transfektion von primären intestinalen Fibroblasten mit Toll-like Rezeptor 4:
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|---|---|
| adam_text | Gliederung 9
Gliederung
I.Einleitung 13
1.1 Aufbau der Darmwand 13
1.2 Rolle der Fibroblasten im Darm 14
1.3 Fibronektin 15
1.4 Toll-like Rezeptoren 18
1.4.1 Drosophila Toll. 18
1.4.2 humane Toll-like Rezeptoren 19
1.4.3 Toll-like Rezeptor 4 21
1.5 EDA als Ligand von TLR4? 23
1.6 Transfektion 24
1.6.1 physikalische Transfektionsmethoden 24
1.6.1.1 Magnetolektion 24
1.6.1.2 biolistische Methode 25
1.6.1.3 Mikroinjektion. 25
1.6.2 biologische Transfektionsmethoden 26
1.6.2.1 Transfektion mit Retroviren 26
1.6.2.2 Transfektion mit Adenoviren 27
1.6.3 biochemische Transfektionsmethoden 27
1.6.3.1 Transfektion durch Präzipitation mit Ca3(PO4)2 27
1.6.3.2 Transfektion mit kationischen Polymeren 28
1.6.3.3 Transfektion mit kationischen Liposomen (Lipofektion) 28
1.7 Transfektion von Fibroblasten 30
2. Arbeitsziele 34
3. Materialien 36
3.1. Chemikalien und Kits 36
3.1.1. Zellkultur 36
3.1.2 Durchflusszytometrie (FACS) 37
3.1.2.1 Antikörper 37
3.1.2.2 Isotypkontrolle 37
3.1.3 Herstellung von Plasmid-Vektoren 37
3.1.3.1 Primer für PCR von FN Fragmenten und Längenstandards 37
3.1.3.2 Polymerase 37
Gliederung 10
3.1.3.3 Aufreinigung und Konzentrationsbestimmung von DNA 38
3.1.3.4 Plasmide und Bakterienstämme 38
3.1.3.5 Restriktionsenzyme und Puffer 38
3.1.3.6 Ligationsreagenz 38
3.1.3.7Plasmid-DNA Isolation 38
3.1.4 Western Blot und SDS-PAGE 38
3.1.4.1 Ripa-Lysepuffer 38
3.1.4.2 Proteinbestimmung 39
3.1.4.3 Probenvorbereitung 39
2.1.4.4 Größenstandard 39
3.1.4.5 SDS PAGE Gel. 39
3.1.4.6 MES/SDS Running-Puffer 39
3.1.4.7NUPAGE Transfer-Puffer 39
3.1.4.8 Wasch-Puffer 40
3.1.4.9 Antikörper 40
3.1.4.10 Detektion 40
3.1.4.11 Stripping 40
3.1.5 IL-8-ELISA 40
3.1.5.1 Waschpuffer 40
3.1.5.2 Blockinglösung 40
3.1.5.3 Standard und Antikörper. 41
3.1.5.4 Substrat 41
3.1.5.5 Stopping Solution 41
3.1.6 MCP-1-ELISA 41
3.1.7 Transfektionsreagenzien 41
3.1.8 Plasmide 41
3.1.9 Fluoreszenzmikroskopie 41
3.2 sonstige Verbrauchsmaterialien 42
3.3 Geräte 43
3.4 Software 44
4.Methoden 45
4.1 Isolierung, Lagerung und Kultur von primären humanen
Colon lamina propria Fibroblasten (CLPFs) 45
4.1.1 Isolierung und Kultur von CLPFs 45
Gliederung 11
4.1.2 Einfrieren der CLPFs 46
4.1.3 Auftauen der Zellen 47
4.1.4 Zellzahlbestimmung 47
4.2 Transfektionsmethoden 48
4.2.1 Transfektion mit jetPEI 48
4.2.2 Transfektion mit FuGENE 6 50
4.2.3 Transfektion mit Lipofectin 51
4.2.4 Transfektion mit Lipofectamine 2000 52
4.3 GFP Nachweis mit Fluoreszenzscanner 53
4.4 Stimulation von mit TLR4 transfizierten Fibroblasten 53
4.5 Durchflusszytometrie 54
4.5.1 Allgemeines zur Methode 54
4.5.2 Beschreibung der Technik 55
4.5.3 Datenanalyse 55
4.6 Herstellung von Expressionsvektoren 56
4.6.1 Polymerasekettenreaktion 56
4.6.2 Gelelektrophorese 57
4.6.3 Restriktions-Verdau 58
4.6.4 DNA Aufreinigung 59
4.6.4.1 PCR DNA Aufreinigung 59
4.6.4.2 Gel Extraktion 60
4.6.4.3 Dialyse 61
4.6.5 ügation 61
4.7 Transformation von Bakterien mit Plasmiden 62
4.7.1 Transformation durch Elektroporation 62
4.7.2 Chemisch Transformation 63
4.8 Glycerinkulturen und DNA Isolation aus Bakteriensuspensionen 64
4.9 Photometrische Bestimmung der DNA Konzentration 66
4.10 Enzyme Linked Immunosorbent Assays 66
4.10.1 Allgemeines zur Methode 66
4.10.2 IL-8-ELISA 67
4.10.3 MCP-1-ELISA 68
4.11 Western Blotting 69
4.11.1 Probenvorbereitung 69
Gliederung 12
4.11.2 Proteinbestimmung (BCA-Protein Assay) 70
4.11.2.1 Allgemeines zur Methode 70
4.11.2.2 Beschreibung der Technik 70
4.11.3 SDS-PAGE [modifiziert nach Lämmli147] 71
4.11.4 Western Blot 71
4.11.5 Stripping 72
4.12 Fluoreszenzmikroskopie 73
4.12.1 Allgemeines zur Methode 73
4.12.2 Herstellung der Präparate 73
4.12.3 Betrachtung der Präparate 74
5. Ergebnisse 75
5.1 Transfektion von primären intestinalen Fibroblasten 75
5.1.1 Optimierung der Transfektionsmethode mit pEGFP-N1 75
5.1.2 Nachweis der Transfektion mit pFLAG-CMV-1-TLR4 82
5.1.2.1 Nachweis der Transfektion mittels Durchflusszytometrie 83
5.1.2.2 Nachweis der Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie 91
5.2 Herstellung von Plasmiden mit FN Domänen und
Transformation von Bakterienzellen 95
5.3 Stimulation von transfizierten und Kontrollfibroblasten 96
5.3.1 Quantifizierung von MCP-1 96
5.3.2 Quantifizierung von IL-8 98
6. Diskussion 100
6.1 Transfektionsmethoden 100
6.2 Optimierung der Transfektion von primären Fibroblasten 102
6.3 EDA und/oder Galektin-3 Ligand von TLR4 104
7. Zusammenfassung 106
8. Ausblick 107
9. Referenzen 108
10. Danksagung 120
11. Lebenslauf 121
|
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Gliederung 9
Gliederung
I.Einleitung 13
1.1 Aufbau der Darmwand 13
1.2 Rolle der Fibroblasten im Darm 14
1.3 Fibronektin 15
1.4 Toll-like Rezeptoren 18
1.4.1 Drosophila Toll. 18
1.4.2 humane Toll-like Rezeptoren 19
1.4.3 Toll-like Rezeptor 4 21
1.5 EDA als Ligand von TLR4? 23
1.6 Transfektion 24
1.6.1 physikalische Transfektionsmethoden 24
1.6.1.1 Magnetolektion 24
1.6.1.2 biolistische Methode 25
1.6.1.3 Mikroinjektion. 25
1.6.2 biologische Transfektionsmethoden 26
1.6.2.1 Transfektion mit Retroviren 26
1.6.2.2 Transfektion mit Adenoviren 27
1.6.3 biochemische Transfektionsmethoden 27
1.6.3.1 Transfektion durch Präzipitation mit Ca3(PO4)2 27
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1.6.3.3 Transfektion mit kationischen Liposomen (Lipofektion) 28
1.7 Transfektion von Fibroblasten 30
2. Arbeitsziele 34
3. Materialien 36
3.1. Chemikalien und Kits 36
3.1.1. Zellkultur 36
3.1.2 Durchflusszytometrie (FACS) 37
3.1.2.1 Antikörper 37
3.1.2.2 Isotypkontrolle 37
3.1.3 Herstellung von Plasmid-Vektoren 37
3.1.3.1 Primer für PCR von FN Fragmenten und Längenstandards 37
3.1.3.2 Polymerase 37
Gliederung 10
3.1.3.3 Aufreinigung und Konzentrationsbestimmung von DNA 38
3.1.3.4 Plasmide und Bakterienstämme 38
3.1.3.5 Restriktionsenzyme und Puffer 38
3.1.3.6 Ligationsreagenz 38
3.1.3.7Plasmid-DNA Isolation 38
3.1.4 Western Blot und SDS-PAGE 38
3.1.4.1 Ripa-Lysepuffer 38
3.1.4.2 Proteinbestimmung 39
3.1.4.3 Probenvorbereitung 39
2.1.4.4 Größenstandard 39
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3.1.4.7NUPAGE Transfer-Puffer 39
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3.1.4.9 Antikörper 40
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3.1.9 Fluoreszenzmikroskopie 41
3.2 sonstige Verbrauchsmaterialien 42
3.3 Geräte 43
3.4 Software 44
4.Methoden 45
4.1 Isolierung, Lagerung und Kultur von primären humanen
Colon lamina propria Fibroblasten (CLPFs) 45
4.1.1 Isolierung und Kultur von CLPFs 45
Gliederung 11
4.1.2 Einfrieren der CLPFs 46
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4.2.1 Transfektion mit jetPEI 48
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4.4 Stimulation von mit TLR4 transfizierten Fibroblasten 53
4.5 Durchflusszytometrie 54
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4.6 Herstellung von Expressionsvektoren 56
4.6.1 Polymerasekettenreaktion 56
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4.7 Transformation von Bakterien mit Plasmiden 62
4.7.1 Transformation durch Elektroporation 62
4.7.2 Chemisch Transformation 63
4.8 Glycerinkulturen und DNA Isolation aus Bakteriensuspensionen 64
4.9 Photometrische Bestimmung der DNA Konzentration 66
4.10 Enzyme Linked Immunosorbent Assays 66
4.10.1 Allgemeines zur Methode 66
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Gliederung 12
4.11.2 Proteinbestimmung (BCA-Protein Assay) 70
4.11.2.1 Allgemeines zur Methode 70
4.11.2.2 Beschreibung der Technik 70
4.11.3 SDS-PAGE [modifiziert nach Lämmli147] 71
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4.11.5 Stripping 72
4.12 Fluoreszenzmikroskopie 73
4.12.1 Allgemeines zur Methode 73
4.12.2 Herstellung der Präparate 73
4.12.3 Betrachtung der Präparate 74
5. Ergebnisse 75
5.1 Transfektion von primären intestinalen Fibroblasten 75
5.1.1 Optimierung der Transfektionsmethode mit pEGFP-N1 75
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5.2 Herstellung von Plasmiden mit FN Domänen und
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5.3 Stimulation von transfizierten und Kontrollfibroblasten 96
5.3.1 Quantifizierung von MCP-1 96
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6. Diskussion 100
6.1 Transfektionsmethoden 100
6.2 Optimierung der Transfektion von primären Fibroblasten 102
6.3 EDA und/oder Galektin-3 Ligand von TLR4 104
7. Zusammenfassung 106
8. Ausblick 107
9. Referenzen 108
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