Etablierung der Allelseparation von HLA-Klasse-I-Genen mittels Temperaturgradientengelelektrophorese zur Gewebetypisierung vor allogener Knochenmark-Transplantation:
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|---|---|
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1 Einleitung _____ /
1.1 Knochenmarktransplantation (KMT) und HLA-System 1
1.2 Molekulare Grundlagen und allelischer Polymorphismus des HLA-Klasse-I-Genlocus4
2 Materialien und Methoden 9
2.1 Materialien _9
2.1.1 Patientenmaterial 9
2.1.2 Reagentien und Kits 9
2.1.3 Lösungen und Puffer 10
2.1.4 Geräte 11
2.1.5 Computerprogramme 12
2.2 Methoden 12
2.2.1 Gewinnung der Patienten-DNA 12
2.2.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 12
2.2.3 Agarose-Gelelektrophorese (AGE) 14
2.2.4 Klonierung und Transformation 14
2.2.5 Gewinnung des klonierten Inserts 15
2.2.6 Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE) 16
2.2.7 Gewinnung von DNA aus dem TGGE-Polyacrylamidgel 18
2.2.8 Sequenzierung „__ 18
3 Ergebnisse 21
3.1 Alleiseparation mittels Klonierung und Sequenzierung 21
3.1.1 Klonierung und Gewinnung von HLA-Klasse-i-Allelen 21
3.1.2 Sequenzanalyse der klonierten HLA-Klasse-I-Gene 21
3.2 Allelseparation mittels TGGE, PCR und Sequenzierung 22
3.2.1 Etablierung des TGGE-Systems für 950-bp-DNA 22
3.2.2 Parallele TGGE der HLA-Klasse-I-Gene 25
3.2.3 Sequenzanalyse der HLA-Klasse-I-Allele nach der TGGE 27
4 Diskussion .^___ 30
5 Zusammenfassung __ . 34
6 Literaturverzeichnis . 35
7 Anhang 40
iv
7.1 Abkürzungen 40
7.2 Protokolle//Kits 41
7.2.1 Original TA Cloning® Kit 41
7.3 Primersequenzen 41
7.3.1 Sequenzen der HLA-A/-B-Intronprimer (Cereb, N et al.. 1995) 41
7.4 Klonierungsergebnis.se 42
|
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iii
1 Einleitung _ /
1.1 Knochenmarktransplantation (KMT) und HLA-System 1
1.2 Molekulare Grundlagen und allelischer Polymorphismus des HLA-Klasse-I-Genlocus4
2 Materialien und Methoden 9
2.1 Materialien _9
2.1.1 Patientenmaterial 9
2.1.2 Reagentien und Kits 9
2.1.3 Lösungen und Puffer 10
2.1.4 Geräte 11
2.1.5 Computerprogramme 12
2.2 Methoden 12
2.2.1 Gewinnung der Patienten-DNA 12
2.2.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 12
2.2.3 Agarose-Gelelektrophorese (AGE) 14
2.2.4 Klonierung und Transformation 14
2.2.5 Gewinnung des klonierten Inserts 15
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2.2.7 Gewinnung von DNA aus dem TGGE-Polyacrylamidgel 18
2.2.8 Sequenzierung „_ 18
3 Ergebnisse 21
3.1 Alleiseparation mittels Klonierung und Sequenzierung 21
3.1.1 Klonierung und Gewinnung von HLA-Klasse-i-Allelen 21
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3.2 Allelseparation mittels TGGE, PCR und Sequenzierung 22
3.2.1 Etablierung des TGGE-Systems für 950-bp-DNA 22
3.2.2 Parallele TGGE der HLA-Klasse-I-Gene 25
3.2.3 Sequenzanalyse der HLA-Klasse-I-Allele nach der TGGE 27
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