Antimikrobielle Peptide als Effektormechanismen der epithelialen Barriere in Anorektalfisteln:
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| adam_text | I Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Kapitel Seile
1. Einleitung 1
1.1 Anorektale Fisteln 2
1.2 Antimikrobielle Peptide und deren Funktion als Effektormechanismen des 3
unspezifischen Immunsystems
1.2.1 Defensine 4
1.2.2 a-Defensine 5
1.2.3 ß-Defenstne 6
1.2.4 Induktion der ß-Defensine durch Zytokine 7
1.2.5 RNase7 7
1.2.6 Psoriasin 8
1.3 Verteilung und Funktion der antimikrobiellen Peptide im menschlichen 8
Gastrointestinaitrakt
1.4 Fragestellung 11
2. Material und Methoden 12
2.1 Gewebeproben 12
2.1.1 Probengewinnung und Lagerung 12
2.1.2 Alter und Geschlecht, Anzahl der Proben 12
2.2 Aufbereitung der Gewebeproben 13
2.2.1 Aufbereitung der Zellen und RNA Isolierung 13
2.2.2 Quantifizierung der Gesamt-RNA 14
2.2.3 Reverse Transkription: Umschreiben von mRNA zu cDNA 14
2.3 Quantifizierung der Gen-Expression mit real-time-PCR 15
2.3.1 Prinzip der real-time PCR 15
2.3.2 Schmelzkurven 17
2.3.3 Verwendete Primer 18
2.3.4 Real-time PCR Ansatz und Durchführung 19
2.3.5 Absolute Quantifizierung der antimikrobiellen Peptide 20
2.3.6 Rekative Quantifizierung der Zytokine 20
2.4 Generierung externer Standards 21
2.4.1 RT-PCR 21
2.4.2 Aufreinigung durch Gelelektrophorese 22
2.4.3 Klonierung und Transfektion 22
2.4.4 Kolonie-PCR und Anlegen einer Masterplatte 22
2.4.5 Plasmidisolierung und Sequenzierung der Insert-tragenden Plasmide 23
2.4.6 Linearisierung des Vektors 23
2.4.7 Messung der DNA-Konzentration 23
II Inhaltsverzeichnis
2.4.8 Erstellung der Standardkurven 24
2.5 Immunhistochemische Färbungen 24
2.5.1 Anfertigung von histologischen Kryoschnitten 24
2.5.2 Anfärbung von hBD-2 und RNase7 mit der Labelled-Streptavidin-Biotin- 24
Methode
2.5.2.1 Prinzip der Methode 24
2.5.2.2 Protokoll der Immunfärbungen 25
2.5.3 Anfärbung von Zytokeratinen in Kryoschnitten durch monoklonale Antikörper 27
2.6 Statistische Analysen 27
3. Ergebnisse 28
3.1 Gen-Expression der ß-Defensine 28
3.1.1 Die Gen-Expression von hBD-1 29
3.1.2 Die Gen-Expression von hBD-2 29
3.1.3 Die Gen-Expression von hBD-3 29
3.2 Gen-Expression der a-Defensine 30
3.3 Gen-Expression von Psoriasin 31
3.4 Gen-Expression von RNase 7 32
3.5 Relative Gen-Expression der Zytokine 33
3.5.1 Relative Gen-Expression von TNF-a und IL-1ß 33
3.5.2 Relative Gen-Expression von IL-6, IL-8 und IL-10 34
3.5.3 Relative Gen-Expression von INF-y 35
3.6 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen der Proteine hBD-2 und RNase7
3.7 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen der Zytokeratine
4. Diskussion 39
4.1 Diskussion der Methodik 39
4.2 Patientenkollektiv 40
4.3 Diskussion der gemessenen mRNA-Expression der antimikrobiellen Peptide und 40
Zytokine
4.3.1 Gen-Expression der ß-Defensine hBD-1, hBD-2 und hBD-3 40
4.3.2 Gen-Expression der a-Defensine 42
4.3.3 Gen-Expression von IL-8 und IL-10 42
4.3.4 Gen-Expression von Psoriasin und RNase 7 43
4.4 Wie kommt es zur Epithelialisierung der Fistel und von welchem Gewebe stammt das **
Epithel?
4.5 Welche Rolle spielt das Fistelepithel als Barriere um lokale Infektionen zu 45
verhindern?
4.6 Könnte eine verminderte Defensinproduktion ein Teilaspekt der epithelialen 4^
Barrierestörung beim Morbus Crohn sein?
ni Inhaltsverzeichnis
5. Zusammenfassung 48
6. Literaturverzeichnis 50
7. Anhang 55
7.1 Materialien 55
7.1.1 Chemikalien 55
7.1.2 Puffer und Lösungen 56
7.1.3 Gele 56
7.1.4 Kits 57
7.1.5 Enzyme und Oligonukleotide 57
7.1.5.1 Enzyme 57
7.1.5.2 Oligonukleotide 57
7.1.6 Antikörper 58
7.2 Verbrauchsmaterialien 58
7.3 Geräte 59
8. Danksagung 60
9. Lebenslauf 61
IV Abbildungsverzeichnis/ Tabellenverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung Seite
Abb. 1.1 Ansicht des menschlichen Analkanals 3
Abb. 1.2 Primärstruktur des HD-5 und hBD-1 mit Darstellung der intramolekularen 5
Disulfidbrücken (SS) bei a- und ß-Defensinen
Abb. 1.3 Lokale Abwehrmechanismen 10
Abb. 2.1 Standardverdünnugsreihe von hBD-3 16
Abb. 2.2 Schmelzkurve für hBD-3 17
Abb. 3.1 Die Gen-Expression der ß-Defensine 28
Abb. 3.2 Die Gen-Expression der a-Defensine 30
Abb. 3.3 Die relative Expression von Psoriasin 31
Abb. 3.4 Die Gen-Expression von RNase 7 32
Abb. 3.5 Die Gen-Expression von TNF-a und IL-1 ß 33
Abb. 3.6 Die Gen-Expression von IL-6, IL-8 und IL-10 34
Abb. 3.7 Immunhistologie für hBD-2, distaler Fistelanteil 36
Abb. 3.8 Immunhistologie für hBD-2, proximaler Fistelanteil 36
Abb. 3.9 Immunhistologie für RNase 7,distaler Fistelanteil 36
Abb. 3.10 Immunhistologie für RNase 7, proximaler Fistelanteil 36
Abb. 3.11 Immunhistologie für CK 5/6, distaler Fistelanteil 38
Abb. 3.12 Immunhistologie für CK 8, distaler Fistelanteil 38
Abb. 3.13 Immunhistologie für CK 5/6, proximaler Fistelanteil 38
Abb. 3.14 Immunhistologie für CK 8, proximaler Fistelanteil 38
Abb. 3.15 Immunhistologie für CK 8, proximaler Fistelanteil 38
Tabellenverzeichnis
Tabelle — ~~ Seite
Tab. 2.1 Anzahl der gesammelten Proben 12
Tab. 2.2 Verwendete Primer 18
Tab. 2.3 Ansatz für real-time PCR 19
Tab. 2.4 Amplifikationsprotokoll real-time PCR 19
Tab. 2.5 Ansatz für RT-PCR 21
Tab. 2.6 Amplifikationsprotokoll für RT-PCR 21
Tab. 2.7 Primäre Antikörper für den Proteinnachweis 24
Tab. 2.8 Sekundäre Antikörper für den Proteinnachweis 25
Tab. 2.9 Pufferlösung für primäre Antikörper 26
Tab. 2.10 Pufferlösung für sekundäre Antikörper 26
Tab. 2.11 Monoklonale Antikörper für die Zytokeratinbestimmung 27
Tab3.1 Relative Expression von IL-10 35
Tab 3.2 Verteilung der Zytokeratine 37
|
| adam_txt |
I Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Kapitel Seile
1. Einleitung 1
1.1 Anorektale Fisteln 2
1.2 Antimikrobielle Peptide und deren Funktion als Effektormechanismen des 3
unspezifischen Immunsystems
1.2.1 Defensine 4
1.2.2 a-Defensine 5
1.2.3 ß-Defenstne 6
1.2.4 Induktion der ß-Defensine durch Zytokine 7
1.2.5 RNase7 7
1.2.6 Psoriasin 8
1.3 Verteilung und Funktion der antimikrobiellen Peptide im menschlichen 8
Gastrointestinaitrakt
1.4 Fragestellung 11
2. Material und Methoden 12
2.1 Gewebeproben 12
2.1.1 Probengewinnung und Lagerung 12
2.1.2 Alter und Geschlecht, Anzahl der Proben 12
2.2 Aufbereitung der Gewebeproben 13
2.2.1 Aufbereitung der Zellen und RNA Isolierung 13
2.2.2 Quantifizierung der Gesamt-RNA 14
2.2.3 Reverse Transkription: Umschreiben von mRNA zu cDNA 14
2.3 Quantifizierung der Gen-Expression mit real-time-PCR 15
2.3.1 Prinzip der real-time PCR 15
2.3.2 Schmelzkurven 17
2.3.3 Verwendete Primer 18
2.3.4 Real-time PCR Ansatz und Durchführung 19
2.3.5 Absolute Quantifizierung der antimikrobiellen Peptide 20
2.3.6 Rekative Quantifizierung der Zytokine 20
2.4 Generierung externer Standards 21
2.4.1 RT-PCR 21
2.4.2 Aufreinigung durch Gelelektrophorese 22
2.4.3 Klonierung und Transfektion 22
2.4.4 Kolonie-PCR und Anlegen einer Masterplatte 22
2.4.5 Plasmidisolierung und Sequenzierung der Insert-tragenden Plasmide 23
2.4.6 Linearisierung des Vektors 23
2.4.7 Messung der DNA-Konzentration 23
II Inhaltsverzeichnis
2.4.8 Erstellung der Standardkurven 24
2.5 Immunhistochemische Färbungen 24
2.5.1 Anfertigung von histologischen Kryoschnitten 24
2.5.2 Anfärbung von hBD-2 und RNase7 mit der Labelled-Streptavidin-Biotin- 24
Methode
2.5.2.1 Prinzip der Methode 24
2.5.2.2 Protokoll der Immunfärbungen 25
2.5.3 Anfärbung von Zytokeratinen in Kryoschnitten durch monoklonale Antikörper 27
2.6 Statistische Analysen 27
3. Ergebnisse 28
3.1 Gen-Expression der ß-Defensine 28
3.1.1 Die Gen-Expression von hBD-1 29
3.1.2 Die Gen-Expression von hBD-2 29
3.1.3 Die Gen-Expression von hBD-3 29
3.2 Gen-Expression der a-Defensine 30
3.3 Gen-Expression von Psoriasin 31
3.4 Gen-Expression von RNase 7 32
3.5 Relative Gen-Expression der Zytokine 33
3.5.1 Relative Gen-Expression von TNF-a und IL-1ß 33
3.5.2 Relative Gen-Expression von IL-6, IL-8 und IL-10 34
3.5.3 Relative Gen-Expression von INF-y 35
3.6 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen der Proteine hBD-2 und RNase7
3.7 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen der Zytokeratine
4. Diskussion 39
4.1 Diskussion der Methodik 39
4.2 Patientenkollektiv 40
4.3 Diskussion der gemessenen mRNA-Expression der antimikrobiellen Peptide und 40
Zytokine
4.3.1 Gen-Expression der ß-Defensine hBD-1, hBD-2 und hBD-3 40
4.3.2 Gen-Expression der a-Defensine 42
4.3.3 Gen-Expression von IL-8 und IL-10 42
4.3.4 Gen-Expression von Psoriasin und RNase 7 43
4.4 Wie kommt es zur Epithelialisierung der Fistel und von welchem Gewebe stammt das **
Epithel?
4.5 Welche Rolle spielt das Fistelepithel als Barriere um lokale Infektionen zu 45
verhindern?
4.6 Könnte eine verminderte Defensinproduktion ein Teilaspekt der epithelialen 4^
Barrierestörung beim Morbus Crohn sein?
ni Inhaltsverzeichnis
5. Zusammenfassung 48
6. Literaturverzeichnis 50
7. Anhang 55
7.1 Materialien 55
7.1.1 Chemikalien 55
7.1.2 Puffer und Lösungen 56
7.1.3 Gele 56
7.1.4 Kits 57
7.1.5 Enzyme und Oligonukleotide 57
7.1.5.1 Enzyme 57
7.1.5.2 Oligonukleotide 57
7.1.6 Antikörper 58
7.2 Verbrauchsmaterialien 58
7.3 Geräte 59
8. Danksagung 60
9. Lebenslauf 61
IV Abbildungsverzeichnis/ Tabellenverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung Seite
Abb. 1.1 Ansicht des menschlichen Analkanals 3
Abb. 1.2 Primärstruktur des HD-5 und hBD-1 mit Darstellung der intramolekularen 5
Disulfidbrücken (SS) bei a- und ß-Defensinen
Abb. 1.3 Lokale Abwehrmechanismen 10
Abb. 2.1 Standardverdünnugsreihe von hBD-3 16
Abb. 2.2 Schmelzkurve für hBD-3 17
Abb. 3.1 Die Gen-Expression der ß-Defensine 28
Abb. 3.2 Die Gen-Expression der a-Defensine 30
Abb. 3.3 Die relative Expression von Psoriasin 31
Abb. 3.4 Die Gen-Expression von RNase 7 32
Abb. 3.5 Die Gen-Expression von TNF-a und IL-1 ß 33
Abb. 3.6 Die Gen-Expression von IL-6, IL-8 und IL-10 34
Abb. 3.7 Immunhistologie für hBD-2, distaler Fistelanteil 36
Abb. 3.8 Immunhistologie für hBD-2, proximaler Fistelanteil 36
Abb. 3.9 Immunhistologie für RNase 7,distaler Fistelanteil 36
Abb. 3.10 Immunhistologie für RNase 7, proximaler Fistelanteil 36
Abb. 3.11 Immunhistologie für CK 5/6, distaler Fistelanteil 38
Abb. 3.12 Immunhistologie für CK 8, distaler Fistelanteil 38
Abb. 3.13 Immunhistologie für CK 5/6, proximaler Fistelanteil 38
Abb. 3.14 Immunhistologie für CK 8, proximaler Fistelanteil 38
Abb. 3.15 Immunhistologie für CK 8, proximaler Fistelanteil 38
Tabellenverzeichnis
Tabelle "— ~~ Seite
Tab. 2.1 Anzahl der gesammelten Proben 12
Tab. 2.2 Verwendete Primer 18
Tab. 2.3 Ansatz für real-time PCR 19
Tab. 2.4 Amplifikationsprotokoll real-time PCR 19
Tab. 2.5 Ansatz für RT-PCR 21
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Tab. 2.7 Primäre Antikörper für den Proteinnachweis 24
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Tab. 2.9 Pufferlösung für primäre Antikörper 26
Tab. 2.10 Pufferlösung für sekundäre Antikörper 26
Tab. 2.11 Monoklonale Antikörper für die Zytokeratinbestimmung 27
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| spelling | Finke, Alexander 1979- Verfasser (DE-588)133206416 aut Antimikrobielle Peptide als Effektormechanismen der epithelialen Barriere in Anorektalfisteln vorgelegt von Alexander Finke 2007 V, 61 Bl. Ill., graph. Darst. txt rdacontent h rdamedia he rdacarrier Kiel, Univ., Diss., 2007 Mikroform-Ausgabe 2007 1 Mikrofiche : 24x Mikrofiche-Ausg.: [Mikrofiche-Ausg.] Signatur des reproduzierten Kulturobjekts: L_x001C_2007 MF 597 s2007 (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Reproduktion von Finke, Alexander, 1979- Antimikrobielle Peptide als Effektormechanismen der epithelialen Barriere in Anorektalfisteln 2007 HBZ Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=016695913&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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