Charakterisierung ionotroper purinerger Rezeptoren im Nucleus medianus praeopticus des anterioren Hypothalamus der Ratte:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2009
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Edition Scientifique
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| Online-Zugang: | lizenzfrei Inhaltsverzeichnis |
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1 EINLEITUNG 1
1.1 DER HYPOTHALAMUS ALS HOMOEOSTATISCHE REGELZENTRUM 1
1.2 DER MNPO - INTEGRATIVES KERNGEBIET DER LAMINA TERMINALIS 2
1.3 ATP - EIN NEUROTRANSMITTER 5
1.4 PURINERGE REZEPTOREN 6
1.4.1 HISTORIE 6
1.4.2 P1-REZEPTOREN (ADENOSIN-REZEPTOREN) 7
1.4.3 INTRAZELLULAERE SIGNALWEGE NACH AKTIVIERUNG VON P1-REZEPTOREN 8
1.4.4 LONOTROPE P2X-REZEPTOREN 9
1.4.5 INTRAZELLULAERE SIGNALWEGE NACH AKTIVIERUNG VON P2X-REZEPTOREN 14
1.4.6 METRABOTROPE P2Y-REZEPTOREN 14
1.4.7 INTRAZELLULAERE SIGNALWEGE NACH AKTIVIERUNG VON P2Y-REZEPTOREN 15
1.5 FREISETZUNGSMECHANISMEN UND EXTRAZELLULAERER ABBAU VON ATP 16
1.6 REGULATION DER KOEPERTEMPERATUR 19
1.6.1 REGELKREIS ZUR KONSTANTHALTUNG DER KOERPERKERNTEMPERATUR 19
1.6.2 FIEBER - EIN SONDERFALL DER THERMOREGULATION 23
1.6.3 PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG PURINERGER SIGNALUEBERTRAGUNG IN DER
THERMOREGULATION 26
1.7 HOMOEOSTASE DES SALZ-UND WASSERHAUSHALTS 33
1.7.1 REGELKREIS ZUR KONSTANTHALTUNG DES SALZ-UND WASSERHAUSHALTS 33
1.7.2 PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG PURINERGER SIGNALUEBERTRAGUNG IN
DEROSMOREGULATION 37
1.8 REGULATION DER NAHRUNGSAUFNAHME 39
1.8.1 HYPOTHALAMISCHE NEUROTRANSMITTERSYSTEME UND LEPTIN/GHRELIN IM
RAHMEN DER HOMOEOSTASE DES ENERGIEHAUSHALTS 39
1.8.2 PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG PURINERGER SIGNALUEBERTRAGUNG IN DER
REGULATION DER ENERGIEHOMOEOSTASE 46
1.9 REGULATION DES SCHLAF-WACH RHYTHMUS 48
1.9.1 BEDEUTUNG (EXTRA)HYPOTHALAMISCHER KERNGEBIETE FUER DIE HOMOEOSTASE
DES ZIRKADIANEN SCHLAF-WACH RHYTHMUS 48
1.9.2 PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG PURINERGER SIGNALUEBERTRAGUNG IN DER
REGULATION DES SCHLAFES 54
1.10 PURINERGE REZEPTOREN UND GLIAZELLEN 57
1.10.1 ASTROCYTEN 57
1.10.2 OLIGODENDROCYTEN 59
1.10.3 MIKROGLIA 61
1.11 ZIELE UND FRAGESTELLUNG DER WISSENSCHAFTLICHEN ARBEIT 65
2 MATERIAL UND METHODEN 68
2.1 MATERIAL 68
2.1.1 GERAETE 68
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/998408166
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
2.1.2 GEBRAUCHSMATERIAL 69
2.1.3 VERBRAUCHSMATERIAL 69
2.1.4 CHEMIKALIEN 70
2.2 VERSUCHSTIERE 73
2.3 VERWENDETE ELEKTROLYTLOESUNGEN UND PUFFER 73
2.3.1 LOESUNGEN FUER DIE IMMUNHISTOCHEMIE 73
2.3.1.1 PHOSPHATPUFFER (PB) 73
2.3.1.2 PRAEINKUBATIONSPUFFER FUER IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN 73
2.3.1.3 INKUBATIONSPUFFER FUER IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN 74
2.3.1.4 PARAFORMALDEHYDLOESUNG (PFA) 74
2.3.1.5 PHYSIOLOGISCHE KOCHSALZLOESUNG 74
2.3.1.6 SACCHAROSELOESUNG (20%) 74
2.3.1.7 INKUBATIONSPUFFER FUER IMMUNCYTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN 75
2.3.1.8 WASCHPUFFER FUER IMMUNCYTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN 75
2.3.2 LOESUNGEN FUER DIE PRIMAERZELLKULTUR DES MNPO 75
2.3.2.1 NEUROBASAL-A-MEDIUM 75
2.3.2.2 GEYS BALANCED SALT SOLUTION (GBSS) 75
2.3.2.3 HANKS BALANCED SALT SOLUTION (HBSS) 75
2.3.2.4 ANSETZEN DER DISPASE-1 LOESUNG 76
2.3.2.5 INAKTIVIERUNGSLOESUNG DER DISPASE-1 76
2.3.3 LOESUNGEN FUER DIE RATIO-IMAGING-MESSUNGEN 76
2.3.3.1 CALCIUMMESSPUFFER 76
2.3.3.2 CALCIUM-MINIMALPUFFER 76
2.3.4 LOESUNGEN FUER DEN IL-6 UND TNF BIOASSAY SOWIE DAS PASSAGIEREN DER
B9- UND WEHI-ZELLLINIE 77
2.3.4.1 IL-6 BIOASSAY- UND B9-ZELLKULTURMEDIUM 77
2.3.4.2 TNF-BIOASSAY- UND WEHI-ZELLKULTURMEDIUM 77
2.3.4.3 MTT-LOESUNG 77
2.3.4.4 ISOPROPANOL-HCI-LOESUNG 77
2.4 METHODEN 78
2.4.1 QUANTITATIVE REAL-TIME POLYMERASEKETTENREAKTION (QRT-PCR) 78
2.4.1.1 GRUNDLAGEN 78
2.4.1.2 GEWINNUNG DER GEWEBEPROBEN FUER DIE QRT-PCR 81
2.4.1.2.1 PRAEPARATION DES MNPO ADULTER TIERE 82
2.4.1.2.2 PRAEPARATION DES MNPO NEONATALER TIERE 82
2.4.1.2.3 PRAEPARATION DER SPINALGANGLIEN 83
2.4.1.3 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA 83
2.4.1.4 QUANTITATIVE UND QUALITATIVE BESTIMMUNG DER RNA 84
2.4.1.5 CDNA-SYNTHESE 85
2.4.1.6 DURCHFUEHRUNG UND AUSWERTUNG DER QRT-PCR 86
2.4.2 PRIMAERE ZELLKULTUR DES MNPO DER RATTE 87
IMAGE 3
2.4.2.1 GRUNDLAGEN 87
2.4.2.2 VORBEREITUNG DER ZELLKULTURKAMMERN 88
2.4.2.3 KULTIVIERUNG VON PRIMAERZELLEN AUS DEM MNPO 88
2.4.3 MESSUNG DER INTRAZELLULAEREN CALCIUMKONZENTRATION MITTELS
RATIO-IMAGING TECHNIK 89
2.4.3.1 GRUNDLAGEN DER RATIO-IMAGING TECHNIK 89
2.4.3.1.1 DER EINSATZ VON FURA-2-ACETOXYMETHL(AM)ESTER IN DER
PRIMAERKULTUR 92
2.4.3.1.2 DER IMAGING-MESSSTAND 92
2.4.3.1.3 VORBEREITUNG DER VERSUCHSDURCHFUEHRUNG 94
2.4.3.2 MESSPROTOKOLLE FUER DIE RATIO-IMAGING TECHNIK 94
2.4.3.2.1 STIMULATION MIT ATP UND 2ME-SATP SOWIE A,SSME-ATP UND 2ME-SATP
95
2.4.3.2.2 STIMULATION MIT BZ-ATP UND 2ME-SATP 96
2.4.3.2.3 STIMULATION MIT DEM P1-REZEPTORAGONISTEN UND 2ME-SATP 96
2.4.3.2.4 DOSISABHAENGIGE SUPERFUSIONSSTUDIE MIT 2ME-SATP 96
2.4.3.2.5 DESENSIBILISIERUNGSSTUDIE MIT 2ME-SATP 97
2.4.3.2.6 HERKUNFT DES CALCIUMS NACH STIMULATION MIT 2ME-SATP 97
2.4.3.2.7 ANTAGONISIERUNG DER 2ME-SATP VERMITTELTEN ERHOEHUNG DER
[CA 2*], Z DURCH PPADS 98
2.4.3.2.8 ANTAGONISIERUNG DER 2ME-SATP VERMITTELTEN ERHOEHUNG DER
[CA 2*] 4 DURCH TNP-ATP 98
2.4.3.2.9 ANTAGONISIERUNG DER 2ME-SATP VERMITTELTEN ERHOEHUNG DER
[CA 2*]* DURCH RB2 99
2.4.3.2.10 EINFLUSS VON ZINK AUF DIE 2ME-SATP-VERMITTELTE ERHOEHUNG
DER [CA 2*] S 99
2.4.3.3 AUSWERTUNG DER RATIO-IMAGING UNTERSUCHUNGEN 99
2.4.4 IMMUNHISTO- UND IMMUNCYTOCHEMIE 101
2.4.4.1 GRUNDLAGEN 101
2.4.4.2 VERWENDETE P2X-SPEZIFISCHE ANTIKOERPER/-SEREN 101
2.4.4.3 IMMUNCYTOCHEMIE: MEHRFACHMARKIERUNG IN DER MNPO-PRIMAERKULTUR 103
2.4.4.4 TRANSKARDIALE PERFUSION 105
2.4.4.5 PRAEPARATION DES GEHIRNS UND ANFERTIGUNG DER GEFRIERSCHNITTE 106
2.4.4.6 GELATINEBESCHICHTUNG DER OBJEKTTRAEGER 107
2.4.4.7 IMMUNHISTOCHEMIE: EINFACHMARKIERUNG DER GEHIRNSCHNITTE 107
2.4.4.8 NEGATIVKONTROLLEN 108
2.4.4.9 AUSWERTUNG DER IMMUNHISTOCHEMISCHEN UNTERSUCHUNGEN 109
2.4.5 CYTOKIN-BIOASSAY 109
2.4.5.1 BIOASSAY VERSUS ELISA 109
2.4.5.2 VERSUCHSANSAETZE 110
2.4.5.3 DER LNTERLEUKIN-6 (IL-6) BIOASSAY 111
2.4.5.3.1 PASSAGIEREN DER B9-ZELLLINIE 111
2.4.5.3.2 DURCHFUEHRUNG UND AUSWERTUNG DES IL-6 BIOASSAYS 111
IMAGE 4
2.4.5.4 DER TUMOR-NEKROSE-FAKTOR ALPHA (TNF-A) BIOASSAY 114
2.4.5.4.1 PASSAGIEREN DER WEHI-ZELLLINIE 114
2.4.5.4.2 DURCHFUEHRUNG UND AUSWERTUNG DES TNF-A BIOASSAYS 114
2.4.5.5 AUSWERTUNG DER BIOASSAYS ZUR ZYTOKINBESTIMMUNG 116
3 ERGEBNISSE 117
3.1 QRT-PCR 117
3.1.1 EXPRESSION PURINERGER REZEPTOREN IM MNPO ADULTER RATTEN 117
3.1.2 EXPRESSION PURINERGER REZEPTOREN IM MNPO NEONATALER RATTEN 118
3.1.3 EXPRESSION PURINERGER REZEPTOREN IN SPINALGANGLIEN ADULTER RATTEN
118
3.1.4 ABSCHLIESSENDE BETRACHTUNG DER REAL-TIME PCR ERGEBNISSE 119
3.2 ERGEBNISSE DER CALCIUM RATIO-IMAGING VERSUCHE 120
3.2.1 STIMULATION DER MNPO-PRIMAERKULTUR MIT ATP UND SEINEN ANALOGA
2ME-SATP BZW. A,SSME-ATP 121
3.2.2 STIMULATION DER MNPO-PRIMAERKULTUR MIT DEM P2X 7-SPEZIFISCHEN
AGONIST
BZ-ATP UND 2ME-SATP 125
3.2.3 STIMULATION DER MNPO-PRIMAERKULTUR MIT P1-AGONISTEN (NECA UND CCPA)
UND 2ME-SATP 127
3.2.4 DOSISABHAENGIGKEIT DER AKTIVIERUNG PURINERGER P2X-REZEPTOREN IN DER
MNPO-PRIMAERKULTUR 129
3.2.5 REPETITIVE, AEQUIMOLARE STIMULATION DER MNPO PRIMAERKULTUR MIT
2ME-SATP 133
3.2.6 HERKUNFT DES CALCIUM NACH STIMULATION MIT 2ME-SATP 141
3.2.7 REAKTIONSMUSTER DER DURCH APPLIKATION VON 2ME-SATP INDUZIERTEN
CALCIUMSIGNALE IN DEN ZELLTYPEN DER PRIMAERKULTUR DES MNPO 143
3.2.8 ANTAGONISIERUNG DER DURCH 2ME-SATP VERMITTELTEN ERHOEHUNG DER [CA
2*] IZ
DURCH PPADS 145
3.2.9 ANTAGONISIERUNG DER DURCH 2ME-SATP VERMITTELTEN ERHOEHUNG DER [CA
2*]^
DURCH DEN P2X,- UND P2X 3- BZW. P2X2RA-SPEZIFISCHEN ANTAGONISTEN TNP-ATP
152
3.2.10 ANTAGONISIERUNG DER DURCH 2ME-SATP VERMITTELTEN ERHOEHUNG DER [CA
2*] IZ
DURCH DEN P2X2- UND P2Y-SPEZIFISCHEN ANTAGONISTEN RB2 167
3.2.11 EINFLUSS VON ZINK ALS POTENTIATOR ODER INHIBITOR AUF DIE DURCH
2ME-SATP
VERMITTELTE ERHOEHUNG DER [CA 2*] TE 170
3.3 IMMUNHISTO- UND CYTOCHEMISCHER NACHWEIS IONOTROPER
PURINERGER REZEPTOREN 172
3.3.1 EXPRESSION DES P2X,-REZEPTORS 173
3.3.2 EXPRESSION DES P2X 2-PURINOZEPTORS 176
3.3.3 EXPRESSION DES P2X4-PURINOZEPTORS 178
3.3.4 ABSCHLIESSENDE BETRACHTUNG 179
3.4 AUSWIRKUNG VON AGONISTEN UND ANTAGONISTEN AN PURINERGEN REZEPTOREN
AUF DIE FREISETZUNG PROINFLAMMATORISCHER ZYTOKINE 180
3.4.1 ATP UND 2ME-SATP INDUZIEREN DIE FREISETZUNG VON TNF-A 180
IMAGE 5
3.4.2 ATP INDUZIERT ZEITABHAENGIG EINE FREISETZUNG VON TNF-A 181
3.4.3 PPADS UND TNP-ATP HEMMEN DIE DURCH LPS INDUZIERTE FREISETZUNG
VON TNF-A 182
3.4.4 ATP UND 2ME-SATP INDUZIEREN DIE FREISETZUNG VON IL-6 184
3.4.5 ATP INDUZIERT ZEITABHAENGIG EINE FREISETZUNG VON IL-6 186
3.4.6 PPADS UND TNP-ATP HEMMEN DIE DURCH LPS INDUZIERTE FREISETZUNG VON
IL-6 188
4 D I S K U S S I ON 190
4.1 CHARAKTERISIERUNG PURINERGER REZEPTOREN IM MNPO 190
4.1.1 NEURONE 192
4.1.2 ASTROCYTEN 199
4.1.3 OLIGODENDROCYTEN 203
4.2 PURINERGE REZEPTOREN IMMUNKOMPETENTER ZELLEN DES MNPO IM
ZUSAMMENHANG MIT DER FREISETZUNG PROINFLAMMATORISCHER ZYTOKINE 206
4.3 AUSBLICK 211
5 ZUSAMMENFASSUNG 213
6 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 219
7 LITERATURVERZEICHNIS 222
8 ANHANG 264
8.1 DANKSAGUNG 264
8.2 ERKLAERUNG 265
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