Isolierung und Charakterisierung equiner mesenchymaler Stammzellen für einen möglichen Einsatz im Tissue Engineering:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Giessen
VVB Laufersweiler
2009
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Edition scientifique
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| Online-Zugang: | Abstract Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | VII, 150 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
I NHALTS VERZEICHN IS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS V
TABELLENVERZEICHNIS VII
1. EINLEITUNG 1
1.1. EINLEITUNG UND STAND DER FORSCHUNG 1
1.2. OSTEOARTHRITIDEN (DEGENERATIVE GELENKERKRANKUNGEN) 2
1.3. VORKOMMEN UND HAEUFIGKEIT VON VERLETZUNGEN DER BAND- UND
SEHNENSTRUKTUREN 6
1.4. KNOCHENLAESION UNTERSCHIEDLICHER GENESE 8
1.5. STAMMZELLEN UND DEREN THERAPEUTISCHE EINSATZMOEGLICHKEITEN 9
2. MATERIAL UND METHODE 14
2.1. LISTE DER VERWENDETEN MATERIALIEN 14
2.2. GERAETE DER ZELLKULTUR 16
2.3. GEWINNUNG EMSC AUS DEM STERNURNASPIRAT VON PFERDEN 16
2.4. AUFBEREITUNG VON EQUINEM KNOCHENMARK 17
2.5. DURCHFUEHRUNG DES MEDIENWECHSELS 18
2.6. DER VORGANG DES PASSAGIERENS 19
2.7. KRYOKONSERVIERUNG MIT PROTEKTION DER ZELLEN 19
2.8. AUFTAUEN DER KRYOKONSERVIERTEN ZELLEN 20
2.9. COLONY FORMING UNITS FIBROBLAST (CFU-F) 21
2.10. NACHWEIS DER ZELLMIGRATION (WOUNDED HEALMG ASSAY) 21
2.11. UNTERSUCHUNG DER ZELLPROLIFERATION 22
2.12. UNTERSUCHUNG DER ZELLVITALITAET DER EMSC BEI UNTERSCHIEDLICHEN
LAGERUNGSBEDINGUNGEN 24
2.13. UNTERSUCHUNG AUF PLURIPOTENZ DER EMSC 24
2.13.1. ADIPOZYTEN- UND OSIEOZYTENDIFFERENZIERUNG...- 25 2.13.2.
CHONDROZYTENDIFFERERTZIERURTG 26
2.14. KULTIVIERUNG DER EMSC UNTER SAUERSTOFFREDUKTION 26
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/99293463X
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.15. ZELLAUFBEREITUNG FUER DIE HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG 27
2.15.1. FIXIERUNG MITTELS PARAFORMALDEHYD 27
2.15.2. FIXIERUNG MITTELS METHANOL / ACETON FUER DIE VAN KOSSA-FAERBUNG 28
2.15.3. FIXIERUNG MITTELS GLUTARALDEHYD / PIKRINSAEURE 28
2.16. HISTOLOGISCHE NACHWEISVERFAHREN 29
2.16.1. RED OIL FAERBUNG ZUM NACHWEIS DER ADIPOGENEN DIFFERENZIERUNG
HAEMATOXILIN GEGENFAERBUNG NACH MAYER 29
2.16.2. NBT/BCIP FAERBUNG ZUM NACHWEIS DER OSTEOGENEN DIFFERENZIERUNG
(ALP FAERBUNG) ZUM KNOCHENNACHWEIS 29
2.16.3. VAN-KOSSA-FAERBUNG ZUM NACHWEIS DER OSTEOGENEN DIFFERENZIERUNG,
ZUM MORPHOLOGISCHEN KALKNACHWEIS (BTT) 30
2.16.4. METACHROMATISCHE TOLUIDINBLAU FAERBUNG ZUM NACHWEIS DER
CHONDROGENEN DIFFERENZIERUNG 31
2.16.5. ALZIANBLAUFAERBUNG ZUM NACHWEIS DER CHONDROGENEN DIFFERENZIERUNG
31
2.17. IMMUNHISTOCHEMIE 32
2.17.1. PRINZIP DER IMMUNHISTOCHEMIE 32
2.17.2. VERWENDETE PRIMAERE ANTIKOERPER 35
2.17.3. VERWENDETE SEKUNDAERE ANTIKOERPER 35
2.18. BRDU- MARKIERUNG 35
2.18.1. BRDU-LABELING IN-VITRO 36
2.19. TRANSFEKTION DER ZELLEN MITTELS EINES ADENOVIRALEN VEKTORS 37
2.20. AUSTESTUNG VON VERSCHIEDENEN TRAEGERMATERIALIEN 37
2.20.1. KOLLAGEN I MATRIX ALS DREIDIMENSIONALES GEL 37
2.20.2. KULTIVIERUNG AUF MICROCARRIERN 38
2.20.3. KULTIVIERUNG DER EMSC AUF MICROCARRIERN IN EINER ROTATIONSKULTUR
IM OSTEOGENEN MEDIUM 39
2.20.4. FIBRINBEADS ALS TRAEGERMATERIAL 40
2.21. EINBETTEN FUER DIE HISTOLOGIE, SOWIE FUER SEMI- UND
ULTRADUENNSCHNITTE 42 2.21.1. PARAFFINEINBETTUNG FUER DAS AUTOTECHNICON
FUER STUECKE BIS ZUR DICKE VON 4 MM 42
2.21.2. EINBETTEN FUER SEMI- UND ULTRADUENNSCHNITTE 43
2.22. MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN 44
2.22.1. RNA ISOLIERUNG 44
2.22.2. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 45
2.22.3. DNASE VERDAU 45
2.22.4. REVERSE TRANSKRIPTION (RT) 46
2.22.5. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) / RT-PCR 46
2.22.6. ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG 48
2.23. MIKROSKOPIE 49
2.23.1. LICHTMIKROSKOPIE 49
2.23.2. FLUORESZENZMIKROSKOPIE 50
2.23.3. ELEKTRONENMIKROSKOPIE 50
2.24. REIMPLANTATION DER ZELLEN 50
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
2.25. BESTIMMUNG DER ZETTZAHL UND GENERATIONSVERDOPPLUNGSZEIT 51 2.25.1.
ZELLZAEHLUNG DER KULTIVIERTEN ZELLEN 51
2.25.2. BERECHNUNG DER GENERATIONSVERDOPPLUNG 52
2.25.3. STATISTISCHE KALKUKALTION DES SIGNIFIKANZNIVEAUS 52
3. ERGEBNISSE 53
3.1. KULTIVIERUNG EQUINER MESENCHYMALER STAMMZELLEN 53
3.2. COLONY FORMING UNITS-FIBROBLAST ASSAY (CFU) 55
3.3. DEMONSTRATIONS DES TEILUNGSPOTENTIALS DER ZELLEN MITTELS KI 67 57
3.4. KRYOKONSERVIERUNG IN FLUESSIGEM STICKSTOFF 58
3.5. UNTERSUCHUNG ZUR VITALITAET DER EMSC BEI LAGERUNG AUF EIS UND BEI
+4 C. 59
3.6. UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES EINER HYPOXISCHEN STOFFWECHSELLAGE AUF
DAS PROLIFERATIONSVERHALTEN DER EMSC S 61
3.7. UNTERSUCHUNG ZUR PROLIFERATIONSAKTIVITAET UND ZUR ZELLEMORPHOLOGIE
IN UNTERSCHIEDLICHEN SEREN UND MEDIEN 64
3.8. UNTERSUCHUNG DER ZELLMIGRATION (WOUNDED HEALING ASSAY) NACH
ANFERTIGUNG EINES SCRATCHES 74
3.9. CHARAKTERISIERUNG DER EMSC MITTELS EINER IMMUNHISTOCHEMISCHEN
FAERBUNG 78
3.9.1. C D 9 0/ THY 1 78
3.9.2. PERLECAN UND FIBRONEKTIN 79
3.9.3. EXPRESSION VON SS1 INTEGRIN 80
3.10. UNTERSUCHUNG ZUR PLURIPOTENZ DER EMSC S ANHAND DES ADIPOGENEN,
OSTEOGENEN UND CHONDROGENEN DIFFERENZIERUNGSPOTENTIALS 81 3.10.1.
ADIPOGENES DIFFERENZIERUNGSPOTENTIAL 81
3.10.2. OSTEOGENES DIFFERENZIERUNGSPOTENTIAL 82
3.10.3. CHONDROGENES DIFFERENZIERUNGSPOTENTIAL 85
3.11. VEKTORTRANSDUKTION EINES ADENOVIRALEN VEKTORS 89
3.12. KULTIVIERUNG AUF TRAEGERMATERIALIEN 93
3.12.1. KOLLAGEN-GEL 93
3.12.2. MICROCARRIER AUS KOLLAGENMATRIX 94
3.12.3. KULTIVIERUNG DER EMSC AUF MICROCARRIERN IN EINER ROTATIONSKULTUR
96 3.12.4. KULTIVIERUNG DER EMSC AUF EINER FIBRINMATRIX. 97
3.13. KLINISCH-THERAPEUTISCHER EINSATZ DER EMSC 102
4. DISKUSSION 104
4.1. ZIELSETZUNG 104
4.2. KRITIK DER METHODE 10S
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
4.3. DISKUSSION DER BEFUNDE 113
4.3.1. ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG DER EQUINEN MESENCHYMALEN STAMMZELLE
113 4.3.2. COLONY FORMING UNIT ASSAY 114
4.3.3. BEURTEILUNG DES PROLIFERATIONSVERHALTENS DER ZELLEN MITTELS KI 67
115 4.3.4. KRYKONSERVIERUNG MIT ANSCHLIESSENDER KULTIVIERUNG 115 4.3.5.
UNTERSUCHUNG ZUR VITALITAET BEI VERSCHIEDENEN LAGERUNGSBEDINGUNGEN 115
4.3.6. EINFLUSS DER SAUERSTOFFKONZENTRATION AUF DIE PROLIFERATION 116
4.3.7. ZELLMIGRATION (WOUNDED HEALRNG ASSAY) 117
4.3.8. ALLGEMEINE CHARAKTERISIERUNG DER EQUINEN MESENCHYMALEN STAMMZELLE
.118 4.3.9. UNTERSUCHUNG DER PLURIPOTENZ 119
4.3.10. TRANSDUKTION DER EMSC MIT EINEM ADENOVIRALEN VEKTOR 121 4.3.11.
EINSATZ VERSCHIEDENER TRAEGERMATERIALIEN 122
4.3.12. KLINISCH-THERAPEUTISCHER EINSATZ DER EMSC 125
4.4. AUSBLICK 128
5. ZUSAMMENFASSUNG 129
6. SUMMARY 132
7. REFERENZ-USTE 135
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