Charakterisierung der Tollwutvakzinen "Rabipur" und "Rabivac" und der enthaltenen Virusstämme FluryLEP und PM 1503:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Giessen
VVB Laufersweiler
2009
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Edition scientifique
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| Online-Zugang: | Abstract Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 12
TABELLENVERZEICHNIS 14
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 15
1. EINLEITUNG 19
1.1 LITERATURUEBERSICHT 1.1.1 DER ERREGER 1.1.1A TAXONOMIE 1.1.1B
EPIDEMIOLOGIE
1.1.1C STRUKTUR UND MORPHOLOGIE DES ERREGERS L.L.LD REPLIKATION 1.1.2
PATHOGENESE 1.1.2A UEBERTRAGUNG
1.1.2B INKUBATIONSZEIT 1.1.2C VIRALE INFEKTION UND AUSBREITUNG 1.1.2D
PATHOLOGIE 1.1.2E IMMUNOLOGIE
1.1.2EA ALLGEMEINE EINFUEHRUNG 1.1.2EB IMMUNANRWORT GEGEN TOLLWUTVIRUS
1.1.2EC ZIELPROTEINE DER ANTIVIRALEN IMMUNANTWORT 1.1.2ED DIE
IMMUNANTWORT NACH IMPFUNG GEGEN TOLLWUT 1.1.3 KLINISCHE SYMPTOMATIK
1.1.4 DIAGNOSE 1.1.5 THERAPIE 1.1.6 PROPHYLAXE
1.1.6A PRAEEXPOSITIONELLE IMMUNISIERUNG 1.1.6B POSTEXPOSITIONELLE
PROPHYLAXE (PEP) 1.1.7 IMPFSTOFFE ZUR ANWENDUNG BEIM MENSCHEN 1.1.7A
QUALITAETSKONTROLLE BEI IMPFSTOFFEN
1.1.7B NEBENWIRKUNGEN
1.2 ZIELSETZUNG DER ARBEIT
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1 MATERIAL 2.1.1 BIOLOGISCHES MATERIAL 2.1.1A VERSUCHSTIERE 2.1.1B
ZELLKULTUREN
2.1.1C VIREN 2.1.2 VAKZINEN
19 20 20 21 25 28 31
31 31 31 33
34 34 36
37 39 39 41 43 43 44 44 47 47
48
51
53
53 53 53 53 54
54
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/100020460X
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
2.1.3 MEDIEN UND PLATTEN 55
2.1.3A MEDIEN FUER ZELLKULTUR 55
2.1.3B MEDIEN UND PLATTEN FUER DIE KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN 57 2.1.4
ZUSAETZE FUER MEDIEN UND AGARPLATTEN 57
2.1.5 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 58
2.1.6 PUFFER UND LOESUNGEN 59
2.1.6A HAEUFIG VERWENDETE PUFFER 59
2.1.6B PUFFER FUER RT-PCR 60
2.1.6C PUFFER FUER SEQUENZIERUNG 61
2.1.6D PUFFER FUER SDS-PAGE 62
2.1.6DA EINDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE (1-D SDS-PAGE) 62 2.1.6DB
ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE (2-D SDS-PAGE) 63 2.1.6E PUFFER FUER
PROTEIN-TRANSFER AUF MEMBRAN 64
2.1.6EA SEMI-DRY TRANSFER 64
2.1.6EB NASSTRANSFER 64
2.1.6F LOESUNGEN FUER PROTEIN-FAERBUNG 65
2.1.6FA COOMASSIE-FAERBUNG 65
2.1.6FB SILBERFAERBUNG 65
2.1.6G PUFFER FUER DIE REINIGUNG DER REKOMBINANTEN PROTEINE 66 2.1.6H
PUFFER FUER KOPPLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN AN SEPHAROSE G 67
2.1.6I PUFFER FUER DIE REINIGUNG DER ANTIKOERPER 68
2.1.6J PUFFER FUER DIE BIOTINYLIERUNG VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN 68
2.1.6K PUFFER FUER EUSA 68
2.1.7 ANTIKOERPER 69
2.1.8 FERTIGE REAGENZIEN UND KITS 70
2.1.9 VERBRAUCHSMATERIALEN 70
2.1.10 GERAETE 71
2.2 METHODEN 73
2.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 73
2.2.1A REVERSE-TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-KETTENREAKTION (RT-PCR) 73
2.2.1AA RNS ISOLIERUNG AUS KULTURZELLEN 73
2.2.LAB REVERSE TRANSKRIPTION 73
2.2.1.AC POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 74
2.2.1B PCR-ANALYSEVONBACULOVIREN 74
2.2. IBA DNS-ISOLIERUNG AUS VIRUSSUSPENSIONEN 74
2.2.1BB POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 75
2.2.1C AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 76
2.2.1D HERSTELLUNG REKOMBINANTER BACULOVIRUS-TRANSFERPLASMIDE 76 2.2.1E
MINI-PRAEPARATION VON PLASMID-DNS 78
2.2.1F RESTRIKTIONSENZYM-VERDAU 78
2.2.1G DNS-SEQUENZIERUNG 79
IMAGE 3
2.2.1H AUSWERTUNG VON SEQUENZEN 79
2.2.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 80
2.2.2A KULTIVIERUNG VON INSEKTENZELLEN (SF-21) 80
2.2.2B KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN 80
2.2.2C TRYPSINIEREN VON ZELLEN 81
2.2.2D BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 81
2.2.2E TRANSFEKTION VON INSEKTENZELLEN 81
2.2.2F PLAQUE-TEST 84
2.2.2G VIRUSVERMEHRUNG 85
2.2.2GA VERMEHRUNG VON REKOMBINANTEN BACULOVIREN 85 2.2.2GB VERMEHRUNG
UND REINIGUNG VON TOLLWUTVIREN 85 2.2.2H TITRATION VON TOLLWUTVIREN 86
2.2.3 PROTEINANALYTISCHE METHODEN 87
2.2.3A PROTEINBESTIMMUNG 87
2.2.3B SDS-PAGE 87
2.2.3BA EINDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE (1-D SDS-PAGE) 87 2.2.3BB
ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE (2-D SDS-PAGE) 88 2.2.3C FAERBUNG VON
PROTEINGELEN 89
2.2.3CA COOMASSIE-FAERBUNG 89
2.2.3CB SILBERFAERBUNG 89
2.2.3D IMMUNOBLOT 90
2.2.3E N-TERMINALE PEPTID-SEQUENZIERUNG 91
2.2.3F MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONISATION TIME-OF-FLIGHT MASS
SPECTROMETRY (MALDI-TOF MS) 91
2.2.4 EXPRESSION UND REINIGUNG DER REKOMBINANTEN PROTEINE 93 2.2.4A
EXPRESSION DES REKOMBINANTEN GLYKOPROTEINS (GP) UND DES NUKLEOPROTEINS
(NP) VON TOLLWUTVIRUS 93
2.2.4B REINIGUNG DER REKOMBINANTEN PROTEINE 93
2.2.4BA AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE 93
2.2.4BB ELEKTROELUTION NACH SDS-PAGE 96
2.2.5 HERSTELLUNG VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN 96
2.2.6 FLUORESCENT ANTIBODY VIRUS NEUTRALISATION TEST - FA VN-TEST 97
2.2.7 ETABLIERUNG EINES ELISAS 98
2.2.7A REINIGUNG VON IGG 99
2.2.7B BIOTINYLIERUNG DER POLYKLONALEN ANTIKOERPER 99
2.2.7C DURCHFUEHRUNG DES ELISAS 100
2.2.7CA VORBEREITUNG DER PROBEN 100
2.2.7CB ABLAUF DES ELISAS 101
2.2.7D BERECHNUNG DER STANDARDKURVE 101
2.2.8 MIKROSKOPIE 103
2.2.8A IMMUNFLUORESZENZ-MIKROSKOPIE 103
2.2.8AA DIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 103
IMAGE 4
2.2.8AB INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 104
2.2.8B IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPIE 104
3. ERGEBNISSE 106
3.1 CHARAKTERISIERUNG DER TOLLWUTVIRUSSTAEMME FLURYLEP UND PM 1503 106
3.1.1 ANALYSEN AUF DER BASIS VON NUKLEINSAEURESEQUENZEN 106 3.1.2
ANALYSEN AUF DER BASIS VON AMINOSAEURESEQUENZEN 108
3.2 GEWINNUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON POLYKLONALEN SEREN 111 3.2.1
HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEN BACULOVIREN 111
3.2.2 EXPRESSION DES GLYKO-/NUKLEOPROTEINS DER TOLLWUTVIRUSSTAEMME
FLURYLEP UND PM 1503 114
3.2.3 REINIGUNG DER REKOMBINANTEN PROTEINE 114
3.2.4 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG POLYKLONALER SEREN 117 3.2.4A
REAKTIVITAET DER SEREN IM IMMUNOBLOT 119
3.2.4B REAKTIVITAET DER SEREN IN DER IMMUNFLUORESZENZ 120 3.2.4C
VIRUSNEUTRALISATION MIT HILFE DER ANTI-G-SEREN 121
3.3 ETABLIERUNG EINES ELISAS 122
3.3.1 STANDARDISIERUNG DES ELISAS 122
3.3.2 QUALITAETSPARAMETER DES ELISAS 124
3.3.2A NACHWEISEMPFINDLICHKEIT 124
3.3.2B REPRODUZIERBARKEIT DES ELISAS 124
3.4. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER IMPFSTOFFE *RABIPUR UND
*RABIVAC 127
3.4.1 QUANTIFIZIERUNG DES NUKLEO-/GLYKOPROTEINS IN DEN VIRUSKONZENTRATEN
UND IN DEN VAKZINEN *RABIPUR UND *RABIVAC MITTELS ELISA 127
3.4.2 IDENTIFIZIERUNG VON NUKLEO-/GLYKOPROTEIN MITTELS
IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPIE 129
3.4.3 NACHWEIS DER PROTEINE IN DEN VAKZINEN *RABIPUR UND *RABIVAC 132
3.4.3A IDENTIFIZIERUNG VIRALER PROTEINE MITTELS IMMUNOBLOT 135 3.4.3B
IDENTIFIZIERUNG VON PROTEINEN MITTELS N-TERMINALER PEPTID- SEQUENZIERUNG
139
3.4.3C IDENTIFIZIERUNG NICHT VIRALER PROTEINE MITTELS IMMUNOBLOT 142
3.4.3D IDENTIFIZIERUNG VON PROTEINEN MITTELS MALDI-TOF MS 144 3.4.3E
ZUSAMMENFASSUNG DER IDENTIFIZIERUNG VON PROTEINEN IN DEN
VIRUSKONZENTRATEN DER TOLLWUTVIRUSSTAEMME FLURYLEP UND PM 1503
SOWIE IN DEN ENTSPRECHENDEN VAKZINEN *RABIPUR UND *RABIVAC 145
3.5 GEWINNUNG VON TOLLWUTVIRUSKONZENTRATEN UND DEREN CHARAKTERISIERUNG
148
3.5.1 VERMEHRUNG VON TOLLWUTVIREN 148
3.5.2 REINIGUNG VON TOLLWUTVIREN 149
IMAGE 5
3.5.3 CHARAKTERISIERUNG DER TOLL WUTVIRUSKONZENTRATE FL BZW. FL* 151
3.5.3A ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER FL BZW. FL* 151
3.5.3B CHARAKTERISIERUNG DER FL BZW. FL* MITTELS 2-D SDS-PAGE 151
4. DISKUSSION 154
4.1 MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG DER TOLLWUTVIRUSSTAEMME FLURYLEP UND PM
1503 154
4.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER TOLLWUTIMPFSTOFFE *RABIPUR UND
*RABIVAC 158
4.2.1 INTEGRITAET VON TOLLWUTVIRUSPARTIKELN 158
4.2.1A DIREKTE UNTERSUCHUNG DER INTEGRITAET VON TOLLWUTVIRUSPARTIKELN 159
4.2.1B INDIREKTE UNTERSUCHUNG DER INTEGRITAET VON TOLLWUTVIRUSPARTIKELN
159
4.2.2 CHARAKTERISIERUNG DER PROTEOME VON VAKZINEN 164
4.2.2A IDENTIFIZIERUNG VIRALER PROTEINE 165
4.2.2B IDENTIFIZIERUNG NICHT VIRALER PROTEINE 166
5. ZUSAMMENFASSUNG 170
6. SUMMARY 172
7. RESUMEN 174
8. LITERATURVERZEICHNIS 176
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