Duale Funktion von Gephyrin: Clustern von inhibitorischen Neurorezeptoren und Molybdäncofaktor-Synthese
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| adam_text | Titel: Duale Funktion von Gephyrin
Autor: Smolinsky, Birthe
Jahr: 2009
Dissertation Birthe SmoHnskv________________________________ Inhafewzalchni»
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung . 1
1.1 Neuronale Funktion von Gephyrin 1
1.1.1 Neuronen und Glia-Zellen 1
1.1.2 Aufbau und Funktton dennhibitorischen Synapse 2
1.1.3 Strukturelle Eigenschaften Liganden-gesteuerter lonenkanäle der Cys-Loop-Faniie 4
1.1.3.1 Aufbau und Funktion von GlyRs 6
1.1.3.2 Aufbau und Funktion von GABAaRs 7
1.1.3.3 Posttranslatjqnale Modifikationen von GABAaRs 9
1.1.3.4 Interaktionspartner von GABAaRs 10
1.1.4 Struktur und Aggregationsverhalten von Gephyrin 11
1.1.5.1 Das Interface zwischen Gephyrin und GlyRs 14
1.1.5.2 Funktion von Gephyrin an glycinergen Synapsen 16
1.1.6 Interaktion von Gephyrin mit GABAsRs 17
1.2 Funktion von Gephyrin im Metabolismus 20
1.2.1 Biosynthese des Molybdäncofaktors 20
1.2.2 Mo-Enzyme in Säugern 23
1.3 Modulation der Gephyrin-Funktion durch alternatives Spleißen 25
1.4 Ziele der Arbeit 28
2 Eigebnisse 29
2.1 Strukturelle Basis der Interaktion von Gephyrin mit GlyRs 29
2.1.1 Identifikation essentieller Reste der Gephyrin-GlyR-WechseWrkung 29
2.2 Direkte Bindung von Gephyrin an GABA Rs 33
2.2.1.1 Expression und Reinigung verschiedener Gephyrtn-Varianten 33
2.2.1.2 Herstellung und Expression von infein-fusioniertenGAfiAAR-ioop^onstrukten 35
2.2.1.3 Kosedimentatbn von Gephyrin mit Irtein-fusionierten GABAaRv-Ioops 38
2.2.1.4 Kosedimentsöonvon Gephyrin mit InteMusionierten GABA*Rß/8-Loops 40
2.2.1.5 Kosedimeniation von Gephyrin mit Intein-fustanierten, verkürzten GABAaRB- 42
2.2.2.1 Herstellung und Expression von GST-fuskmiertenGABAAR-Loop-Konsirukten 45
2.25.2 Kosedimentetfon von Gephyrin mit GST-fusfonierten GABAaR-Lgops 45
2.2.2.3 CharaMensierangderlntßraktbnGST-fustonierier6ABAAR4jMpsmit6ept)yrin 48
2.2.2.4 Kosedimentatjon von Gephyrin mit phosphomimeüschen GABAaRv2-Logps 49
2.2.2.5 Eingrenzung des Gephyrin-Bindungsmotws auf dem GABAARß2-L.oops 51
2.2.3 Interaktion von Gephyrin mit gereinigten GABAsR-töops 52
2.2.3.1 Herstellung von His-markiertenGABAAR-Loop-Konstnikten, Expression und 53
2.2.3.2 Reinigung GST-fusionierter und isolierter GABAaR-Loops 54
2.2.3.3 Analytische Gellirationsiäufe mit Gephyrin und gereinigten GäBAaR4.oqps 57
2.3 öwersat von Gephyrin-Spteiß-Varianten und ihre Funktion in der Molybdancofator-
BtosynBiese 80
2.3.1 Komptenentata der Moco-SynthesemL929 Zeilen durch GephyitoSpWS-Va^nton 60
2-3.2 KompfaitenMontelteHSy^^ 65
2.3.3 Bfo(^mfecteCharakterisiefingvon6epoG^2 67
2.3.4 MPT undMoco-GehalthvwK*ifedenen murinert ögan« 69
2.3.5 Moco-Syntiese in Gfa-Men und Neuronen 70
2.3.6 Heßtefcr^undOiaraltofeientngSplefrKasseasnspezfedwAfllkaf« 72
2.3.6.1 62^Aiüköfper 73
2.3.6.2 CÄAnihMper . ¦ 74
JnhalteverzeMmis
75
2.3.6.3 C4a- und C4c-Anfikörper
77
3 Diskussion 77
31 Interaktion von Gephyrin mit inhibitorischen Neurorezeptoren 77
3.1.1 Identifizierung essentieller Reste des Gephyrin GlyR Interfaces g0
3.1.2 Direkte Bindung von Gephyrin an GABAaRs 80
3.1.2.1 Kosedimentation von Gephyrin mit den GABAaR-Loods o2, ß2, ß3 und 6 : g3
3.1.2.2 Bindung der GABAaR-Loops an die Gephyrin E-Domäne 84
3.1.2.3 Identifizierung der Gephyrin-Bindungsstelle auf dem GABAaRP2-Loop 8g
3.1.2.4 Charakterisierung der Gephyrin GABAaR Interaktion ^
3.1.2.5 Kolokalisation von Gephyrin mit GABAaRs 91
3.1.2.6 Potentielle Funktion von Gephyrin an GABAergen Synapsen g3
3.1.2.7 Ausblick 94
3.2 Gephyrin-Spleiß-Varianten und ihre Rolle in der Moco-Syntnese ^
3.2.1 Modulation der Cofaktor-Synthese durch Gephyrin-Spleiß-Varianten 97
3.2.2 Moco-Synthese in neuronalen und nicht-neuronalen Geweben 99
3.2.3 Spleiß-Kassetten-spezifische Antikörper 100
3.2.4 Ausblick
102
4 Material und Methoden 102
4.1 Materialien 102
4.1.1 Enzyme und Chemikalien 102
.4.1.2 Organismen und Stämme 103
4.1.3 Plasmkte . 104
4.2 Motekularbiologische Methoden . 104
4.2.1 Ktonierungstechniken 104 .
4.2.2 Polymerase-Ketien-Reaktion - 105
4.3 Biochemische Methoden 105
4.3.1 Oberexpression rekombinanter Proteine in £ coü 106
4.3.2 Reinigung rekombinanter Proteine 106
4.3.2.1 Affinitätsaufreinigung von Proteinen mit His-Tag Fusion _ 107
4.3.2.2 Affinitäteaufreinigung von Proteinen mit Intän-Tag und Chitinbindungsdomane 1Qg
4.3.2.3 Aufreinigung GSMisfonierter Proteine 108
4.3.2.4 ÄnioTßn-undKationenaustaugcrierchrornatographie . 109
4.3.2.5 Hydrophobe Inteiakficmschrömatographie 109
4.3.2.6 Gräßenausschlusschromatographie HO
4.3.2.7 Konzentrierung von Proteinlösungen HO
4.3.3 Konzentrationsbestimmung von Proteinen HO
4.3.4 SDS-Polyacrylamid-Geielektrophorese 111
4.3.5 Immunblot-Analyse H2
4.3.6 Herstellung von Organ-Rohextrakten H2
4.3.7 Analytische Methoden H2
4.3.7.1 Kosedimentettonmittrttein/CBD-fustorfertenProtäneri H3
4.3.7.2 Kosedimentation mit GSPfusionterten Proteinen 114
4.3.7.3 Analytische Gelitratjbnslä* H4
4.3.7.4 Nachweis von MPT und Moco durch nf-1 RetonstMon H5
4.3.7.5 InvSro Synthese von MPT und MPT-AMP ¦ 115
4.3.7.6 Nachweis von MPT, MPT-AMP und Moco Awh HPLC-Besftnmung 116
4.4 Zellbiotogische Me*oden . H6
4.4.1 KuWviefungäerischerZ^m .- - ¦ ^7
4.4.2 Transfektei tierischer i» • - - ¦ H7
Dissertation Birthe Smolinskv________________________________________Inhaltsverzeichnis
4.4.4 Ernten und Aufschluss transfizierter Zellen 118
4.4.5 Herstellung monoklonaler Antikörper . 118
5 Anhang 119
5.1 Primer 119
5.2 Konstrukte 120
5.3 Sequenzen 122
5.3.1 Gephyrinsequenz 122
5.3.2 Sequenzen der GABAAR-Untereinhe rten 123
6 Literaturverzeichnis 127
Dissertation Birthe Smolinskv_______________________________;_________Abbildunasverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1,1 Aufbau einer gemischten inhibitorischen Synapse 3
Abb. 1,2 Aufbau von GABAaRs und GiyRs . 5
Abb. 1.3 Struktur der Gephyrin-G-und-E-Domäne 12
Aggregatjonsverhalten von Gephyrin • ^
Abb. 1.5 Struktur der Gephyrin-E-Domäne im Komplex mit gebundenem GlyRß-Loop-
Peptid 15
Abb. 1.6 Funktion von Gephyrin in der Moco-Synthese ^
Abb. 1.7 Anordnung alternativer Spleiß-Kassetten in den Gephyrin-Domänen 25
Abb. 2.1 Koexpression von Gephyrin-Varianten mit GlyRß-Loop-Varianten in HEK 293
Zellen 31
Abb. 2.2 Aufreinigung von rGeph-C4c (-P713E) M
Abb. 2.3 Strategie zur Ktonierung von pTYB2:GABAAR-LoopKonsfrukten 37
Abb. 2.4 Kosedimentatbn {Pulldom} verschiedener Gephyrin-Varianten mit Intein-
fusionierten GABAaRv-Loods 39
Abb. 2.5 Kosedimentatton [PulUom) verschiedener Gephyrin-Varianten mit den
Intein-fusionierten GABAARß1-3-Loops und dem GABAaRÖ-Loop 41
Abb. 2.6 KosedimentaBon {Pulldown) von Gephyrin mit verkürzten GABÄARß2-Loops tt
Abb. 2.7 Kosedimentatbn (PulUom) verschiedener Gephyrin-Varianten mit GST-
fusionierten GABAaR-Loop 47
Abb. 2.8 Salzabhängigkeit der Kosedimentatton von Gephyrin durch den GABAaRcö-,
ß2-,ß3-undö-ioop ¦ • 49
Abb,2.9 Kosedimentatbn (PulMom) von Gephyrin mit phosphomimetischen
GABAaRy2-Loops M
Abb. 2.10 Kosedimentetbn(ft;//rfown) von Gephyrin mit verkürzten GABAARß2-Loops
Abb. 2.11 AufreingungvonHis-getaggtemGABAARai-Loop 5Z
Abb. 2.12 Aufreinkjung GST-getaggter GABAaR-Loods am Beispiel des GABAaRo2-
Loops ^
Abb.2.13 Analytische GeifiratfonsJäufe mit Gephyrin und gereinkjten GST-getaggtei
Abb.2.14 In dieser Arbeit für Komplsmentatfonssturten eiigesetzte Gephyrin-Spteiß-
Varianten . . 61
Dissertation Birthe Smolinskv_____________________________________Abbildunasverzeichnis
Abb. 2.15 Expression von Gephyrin-Spleiß-Varianten in L929 Zellen 62
Abb. 2.16 Komplementatton Moco-defizienter L929 Zellen durch Gephyrin-Spleiß-
Varianten 63
Abb. 2.17 Komplementafion Moco-defizienter L929 Zellen mit unterschiedlich getaggtem
Gephyrin • 64
Abb. 2,18 Komplementaiion Moco-defizienter £ coli mogA- und moeA-Mutanten durch
Gephyrin-Varianten 66
Abb. 2.19 Biochemische Charakterisierung von GephG-G2 68
Abb. 2.20 MPT-, Moco- und Gephyrin-Gehalt in murinen Organen 70
Abb. 2.21 Gephyrin-und Moco-GehaltinGlia-Zellen und Neuronen 71
Abb. 2.22 Schemattsche Darstellung der Antigene zur Herstellung Spleiß-Kassetten-
spezifischer-Antikörper 73
Abb. 2.23 Herstellung und Charakterisierung monoklonaler anti-C3 Antikörper 75
Abb. 2.24 Herstellung und Charakterisierung monoklonaler anti-fC4a Antikörper 76
Abb. 3.1 Sequenz-AlignmentderGABAAR-Loopscß, ß2, ß3unda 87
Abb. 3,2 Struktur des GephG-Trimers und GephE-Dimers mit Spleiß-Kassetten-
Inserijonen 96
Abb. 3.3 Sequenz-Alignment der C3- und C4a-Kassetien verschiedener Vertebraten 100
Dissertation Birthe Smolinskv_____________________:___________________Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tab. 1.1 Auftreten von Spleiß-Kassetten in Gephyrin-Transkripten und Proteinen
verschiedener Gewebe 2°
Tab. 2.1 Aminosäuresequenzen der cytoplasmatischen Loops der GABAaR-
Untereinheiten a1-6, ß1-3,5 und v1-3 aus M. musculus 36
Tab. 3,1 Kolokalisation von Gephyrin mit GABAaR-Loops in HEK 293 Zellen und
Neuronen - *
Tab. 4.1 Verwendete Bakterienstämme und Zelllinien ^2
Tab. 4.2 Verwendete Plasmkie 103
Tab. 4.3 Expressionsbedingungen der in dieser Arbeit verwendeten bakteriellen
Expressionskonsirukte
Tab. 4.4 Verwendete primäre und sekundäre Antikörper ^ * ¦
Tab. 5.1 Verwendeten Primer und ihre Sequenzen
Tab. 5.2 Verwendete Konstrukte . 120
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