Entwicklung einer PCR-gestützten Klonalitätsdiagnostik bei B-Zell-Lymphomen der Katze:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen
VVB Laufersweiler
2008
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Edition scientifique
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| Online-Zugang: | Abstract Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | V, 183 S. Ill., graph. Darst. |
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IMAGE 1
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURUEBERSICHT 2
2.1 NEOPLASTISCHE PROLIFERATIONEN VON BLUTZELLEN 2
2.2 EINTEILUNG DER LYMPHATISCHEN PROLIFERATIONEN BEI DER KATZE 2
2.2.1 MAKROSKOPISCHE EINTEILUNG 2
2.2.2 HISTOLOGISCHE EINTEILUNG 3
2.2.2.1 WHO-KLASSIFIKATION HAEMATOPOETISCHER TUMOREN DER HAUSTIERE 3
2.2.2.2 WHO-KLASSIFIKATION DER IN DER ARBEIT VERWENDETEN NEOPLASIEN 5
2.2.2.2.1 B-ZELL-LYMPHOME 5
2.2.2.2.1.1 FOLLIKELZENTRUMS-LYMPHOM TYP II 5
2.2.2.2.1.2 DIFFUSES GROSSZELLIGES B-ZELL-LYMPHOM 5
2.2.2.2.2 T-ZELL-LYMPHOME 6
2.2.2.2.2.1 INTESTINALES T-ZELL-LYMPHOM 6
2.2.2.2.2.2 LYMPHOBLASTISCHES T-ZELL-LYMPHOM 6
2.3 AETIOLOGIE LYMPHATISCHER PROLIFERATIONEN BEI DER KATZE 6
2.3.1 DAS FELINE LEUKAEMIEVIRUS (FELV) 6
2.3.1.1 VORKOMMEN BEI LYMPHATISCHEN PROLIFERATIONEN 6
2.3.1.2 TUMORPATHOGENESE 7
2.3.2 DAS FELINE IMMUNDEFIZIENZ VIRUS (FIV) 8
2.4 LIMITIERUNG DER HISTOLOGISCHEN DIAGNOSTIK LYMPHATISCHER
PROLIFERATIONEN 8 2.5 KLONALITAETSANALYSE 9
2.5.1 UNTERSUCHUNG DER INAKTIVIERUNG VON X-CHROMOSOMEN 9
2.5.2 NACHWEIS SOMATISCHER MUTATIONEN 10
2.5.3 ANALYSE VIRALER INTEGRATIONEN 11
2.5.4 LYMPHOZYTENANALYSE 11
2.5.4.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE GRUNDLAGEN 11
2.5.4.1.1 B-ZELLEN 11
2.5.4.1.2 AUFBAU DES B-ZELL-REZEPTORS J 12
2.5.4.1.3 V(D)J-REKOMBINATION 13
2.5.4.1.4 MECHANISMEN ZUR ERHOEHUNG DER ANTIKOERPERDIVERSITAET 16
2.5.4.1.4.1 KOMBINATORISCHE DIVERSITAET 16
2.5.4.1.4.2 JUNKTIONALE DIVERSITAET 16
2.5.4.1.4.3 SOMATISCHE HYPERMUTATION 18
2.5.5 DIAGNOSTISCHE ANWENDUNG 19
2.5.5.1 HUMANMEDIZIN 19
2.5.5.1.1 SOUTHERN BLOTTING 19
2.5.5.1.2 PCR 20
2.5.5.1.2.1 B-ZELL-NEOPLASIEN 21
2.5.5.2 VETERINAERMEDIZIN 22
2.5.5.2.1 HUND 22
2.5.5.2.2 KATZE 22
3 MATERIAL UND METHODEN 24
3.1 VORBEMERKUNG 24
3.2 BIOLOGISCHES MATERIAL 26
3.2.1 HISTOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE DIAGNOSE DER VERWENDETEN
PROBEN. 28 3.3 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 29
3.3.1 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNS AUS UNFIXIERTEM GEWEBE MITTELS
PURESCRIPT 8 RNA PURIFICATION KIT 29
3.3.2 ISOLIERUNG VON MRNA AUS GESAMT-RNS MITTELS OLIGOTEX MRNA KIT 30
I
GESCANNT DURCH
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/989809153
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.3 ISOLIERUNG VON DNS MITTELS PUREGENE DNA PURIFICATION KIT 31
3.3.3.1 ISOLIERUNG VON DNS AUS UNFIXIERTEM GEWEBE 31
3.3.4 ISOLIERUNG VON DNS AUS FORMALINFIXIERTEM UND IN PARAFFIN
EINGEBETTETEM GEWEBE 32
3.3.4.1 ISOLIERUNG MIT DEM PUREGENE DNA PURIFICATION KIT 32
3.3.4.2 ISOLIERUNG DURCH HITZEBEHANDLUNG, CHELEX 100 UND
CHLOROFORMEXTRAKTION. 34 3.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON
NUKLEINSAEUREN 35
3.4.1 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 35
3.4.2 ELEKTOPHORETISCHE INTEGRITAETS- UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 35
3.5 AMPLIFIKATION VON NUKLEINSAEUREN 36
3.5.1 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE 36
3.5.2 PCR-VERFAHREN 38
3.5.2.1 PRIMERTEST 38
3.5.2.1.1 ERGEBNISKONTROLLE 39
3.5.2.2 REVERSE TRANSKRIPTASE PCR (RT-PCR) 40
3.5.2.3 PCR MIT DEM SMART* RACE AMPLIFICATION KIT 41
3.5.2.4 CAPFISHING* TECHNIK 43
3.5.2.5 AMPLIFIKATION DER CDNA MIT DER PHUSION* HIGH FIDELITY
DNA-POLYMERASE.45 3.5.2.5.1 LEADER-PCR 46
3.6 AUFREINIGUNG VON DNS 46
3.7 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN 48
3.7.1 ACCEPTOR* VECTOR KIT 48
3.7.2 AGAR-NAEHRBOEDEN UND FLUESSIGKULTURMEDIEN 48
3.7.3 DATP *TAILING" DER PCR-PRODUKTE 49
3.7.4 VORBEREITUNG DER DNS FUER DIE KLONIERUNG 49
3.7.5 LIGATION UND TRANSFORMATION 49
3.7.6 KOLONIE-PCR 50
3.7.7 ANZUCHT GEEIGNETER KOLONIEN UND PLASMIDPRAEPARATION 51
3.7.8 BIOLOGISCHE SICHERHEIT 53
3.7.9 KONTROLLE DER PLASMIDE 53
3.8 SEQUENZIERUNG UND AUSWERTUNG DER SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE 54
3.9 TEST DES DIAGNOSTISCHEN PRIMERSYSTEMS 54
3.9.1 UEBERPRUEFUNG DER DNS-QUALITAET 54
3.9.2 AMPLIFIKATION DES CDR3 DER SCHWEREN KETTE DES FELINEN
IMMUNGLOBULINS. 55 3.9.2.1 QIAGEN MULTIPLEX PCR KIT 57
3.9.3 ERGEBNISKONTROLLE (SDS-PAGE) 58
3.9.4 HETERODUPLEXANALYSE 60
4 ERGEBNISSE 61
4.1 ANALYSE DER SCHWEREN KETTE DES FELINEN IMMUNGLOBULINS 61
4.1.1 VERIFIZIERUNG DER VEROEFFENTLICHTEN SEQUENZ DER C-REGION DER
SCHWEREN KETTE DES FELINEN IGMS 62
4.1.2 ANALYSE DER WEITER IN RICHTUNG 5'-ENDE GELEGENEN SEQUENZEN 62
4.1.2.1 SMART* RACE-TECHNIK 62
4.1.2.2 LEADER-PCR 64
4.1.2.3 CAPFISHING*-TECHNIK 66
4.2 ENTWICKLUNG DER DIAGOSTIKPRIMER 67
4.2.1 SENSE-PRIMER 67
4.2.2 ANTISENSE-PRIMER 68
4.2.3 UEBERPRUEFUNG DER PRIMER 71
4.3 ETABLIERUNG DES DIAGNOSTIK-SYSTEMS 71
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.1 ELEKTROPHORESE 71
4.3.2 ISOLIERUNG DER PROBEN-DNS 72
4.3.2.1 FRISCHMATERIAL 72
4.3.2.2 FORMALINFIXIERTES UND IN PARAFFIN EINGEBETTETES GEWEBE 72
4.3.3 AMPLIFIKATION DES CDR3 73
4.3.4 HETERODUPLEXANALYSE 73
4.3.5 ERGEBNISSE DER MIT DEM DIAGNOSTIKSYSTEM UNTERSUCHTEN PROBEN 74
4.3.5.1 B-ZELL-LYMPHOME 74
4.3.5.1.1 FAELLE 3020/92 UND 3597/06 74
4.3.5.1.2 FAELLE T383/05 UND TL528/07 76
4.3.5.1.3 FAELLE 2253/97 UND 2047/95 79
4.3.5.1.4 FAELLE T7795/05 UND 940/97 82
4.3.5.1.5 FAELLE T7192/06 UND S1003/04 85
4.3.5.2 LYMPHATISCHE HYPERPLASIEN 87
4.3.5.2.1 FAELLE T847/05 UND T878/05 87
4.3.5.2.2 FAELLE T630/05 UND T273/05 89
4.3.5.2.3 FAELLE T3746/05 UND T6950/05 91
4.3.5.2.4 FAELLE T7426/06 UND S1592/04 93
4.3.5.2.5 FAELLE S345/07 UND S348/07 95
4.3.5.3 T-ZELL-LYMPHOME 96
4.3.5.3.1 FAELLE 1883/94 UND S1017/05 96
4.3.5.3.2 FAELLE 2155/90 UND 280/92 97
4.3.5.3.3 FAELLE 93/93 UND 1989/98 98
4.3.5.3.4 FAELLE 1379/99 UND 1945/90 99
4.3.5.3.5 FAELLE 217/94 UND 15/96 100
4.3.6 AMPLIFIKATION DER VH1-POSITIVKONTROLLE IN GETRENNTEN ANSAETZEN 101
5 DISKUSSION 102
5.1 ANALYSE DER SCHWEREN KETTE DES FELINEN IMMUNGLOBULINS 102
5.1.1 ANALYSE DER GENE DER SCHWEREN KETTE MIT DER SMART* RACE-TECHNIK
. 102 5.1.2 ANALYSE DES NCBI TRACE ARCHIVS 103
5.1.3 LEADER-PCR 104
5.1.4 ANALYSE MIT DER CAPFISHING* TECHNIK 105
5.2 DIAGNOSTIKPRIMER 105
5.2.1.1 VERGLEICH MIT DEM BESTEHENDEN DIAGNOSTIKSYSTEM 106
5.3 HORIZONTALE SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 107 5.4
DNS-ISOLIERUNG UND QUALITAET DER GEWONNENEN DNS 108
5.5 LIMITIERUNG DER KLONALITAETSANALYSE VON B-ZELL-LYMPHOMEN MIT DER
PCR. 109 5.5.1 FALSCH NEGATIVE RESULTATE 109
5.5.2 FALSCH POLYKLONALE RESULTATE 110
5.5.3 FALSCH KLONALE RESULTATE 111
5.5.3.1 PSEUDOMONOKLONAL 111
5.5.3.2 OLIGOKLONAL 112
5.6 KRITERIEN FUER DIE INTERPRETATION DER ELEKTROPHORESE-ERGEBNISSE 112
5.7 HETERODUPLEXANALYSE 113
5.8 AUSSAGEKRAFT DER ELEKTROPHORESE-RESULTATE 114
5.9 ANALYSE DER MIT DEM DIAGNOSTIKSYSTEM AMPLIFIZIERTEN PROBEN 114
5.9.1 DUPLIZIERUNG DER FR 1-SPEZIFISCHEN BANDE DER VH1-POSITIVKONTROLLE
114 5.9.2 DISKUSSION DER ERGEBISSE DER MIT DEM PRIMERSYSTEM UNTERSUCHTEN
PROBEN .115 5.9.2.1 B-ZELL-LYMPHOME 115
5.9.2.1.1 FALL 3020/93 115
III
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
5.9.2.1 5.9.2.1 5.9.2.1 5.9.2.1 5.9.2.: 5.9.2.1 5.9.2.1 5.9.2.1 5.9.2.1
5.9.2.1 5.9.3 5.9.4
5.9.5
6
7
8
8.1 8.1.1 8.1.2 8.2 8.3 8.4
8.5 8.6 8.7
8.9 8.10
8.11 8.12
8.13 8.14 8.15 8.15.1
8.15.1.1 8.15.2 8.15.2.1 8.15.2.2 8.15.2.3 8.15.2.4 8.15.2.5 8.15.2.6
8.15.3 8.15.3.1 8.15.3.2
.3 .4
.6
.9 .10 .11
FALL 3597/06 115
FALL T383/05 116
FALL T1528/07 116
FALL 2253/97 118
FALL 2074/95 118
FALL T7795/05 119
FALL 940/97 119
FALLT7192/06 119
FALLS1003/04 120
ZUSAMMENFASSUNG DER UNTERSUCHTEN B-ZELL-LYMPHOME 120
LYMPHATISCHE HYPERPLASIEN 121
T-ZELL-LYMPHOME 121
BEURTEILUNG DES DIAGNOSTISCHEN SYSTEMS 122
ZUSAMMENFASSUNG 123
LITERATURVERZEICHNIS 125
ANHANG 135
VERWENDETE LAENGENSTANDARDS 135
PUC19/MSPI 135
MF 136
GIESSBLOCK FUER DIE HORIZONTALE SDS-PAGE 136
TAGEBUCHNUMMERN, ART DER FIXIERUNG UND DNS-ISOLIERUNG 137
TAGEBUCHNUMMERN, RASSE, ALTER UND GESCHLECHT DER FUER DIE DNS-ISOLIERUNG
VERWENDETEN KATZEN SOWIE LOKALISATION DER PROBE 141
HISTOLOGIE DER MIT DEM DIAGNOSTIKSYSTEM UNTERSUCHTEN B-ZELL-LYMPHOME.
144 HISTOLOGIE DER PROBE 1883/94 (T-ZELL-LYMPHOM) 154
HISTOLOGIE DER PROBE 878/05 (LYMPHATISCHE HYPERPLASIE) 155
LOKALISIERUNG VON LEADERREGION, SMART II* OLIGONUKLEOTID, V-REGION, CDR3
UND C-REGION IN DEN INSERTS 156
SEQUENZEN DERCDR3 UND DIE DAZU ENTSPRECHENDEN HUMANEN GENE 158
VEROEFFENTLICHTER TEIL DER C-REGION DER SCHWEREN KETTE DES FELINEN IGM
(CHO ET AL., 1998) 162
VERZEICHNIS DER KLONE (SEQUENZEN DER INSERTS) 162
SEQUENZ DER BEI DER UNTERSUCHUNG VON FALL TL 528/07 AUFGETRETENEN
NEBENBANDE 169
BEZUGSQUELLEN FUER CHEMIKALIEN, ENZYME, KITS UND ANTIKOERPER 170
BEZUGSQUELLEN FUER GERAETE UND EINMALARTIKEL 172
LOESUNGEN UND PUFFER 175
PCR 175
DEPC-WASSER - RNASE-FREIES WASSER 175
ELEKTROPHORESE 175
LOXTBE-PUFFER 175
40XTAE-PUFFER 175
0,5XT-PUFFER 175
15%IGE FICOLL-LOESUNG ZUM BELADEN DER GELTASCHEN 176
2%IGE UND 3 %IGE AGAROSEGELE 176
GLASPLATTEN SILANISIEREN 176
KLONIERUNG 176
LB MEDIUM 176
LB AGAR 177
IV
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 178 |
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