Molekularbiologischer Nachweis mutmaßlicher Virulenzfaktoren bei Staphylococcus-aureus-Kulturen, isoliert von Rindermastitiden:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen
VVB Laufersweiler
2007
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Edition scientifique
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| Online-Zugang: | Abstract Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | XIII, 184 S. Ill., graph. Darst. |
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Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS Seite
1 EINLEITUNG.1
2 LITERATURÜBERSICHT.2
2.1 Euterenzündungen bei Rindern.2
2.1.1 Ursachen für Euterentzündungen.3
2.1.2 Klinisches Bild und Verlauf.4
2.1.2.1 Akute Euterentziindungen.4
2.1.2.2 Chronische und subklinische Euterentzündungen.4
2.2 Staphylococcus aureus als Mastitiserreger des Rindes.5
2.2.1 Morphologie.6
2.2.2 Selektivnährmedien.7
2.2.3 Epidemiologie.7
2.3 Mutmaßliche Virulenzfaktoren.8
2.3.1 Extrazelluläre Enzyme.10
2.3.1.1 Thermonukiease.10
2.3.1.2 Koagulase.10
2.3.2 Protein A.11
2.3.3.1 Clumping factor.13
2.3.3.2 Fibronektin-bindendes Protein.14
2.3.3.3 Kollagen-bindendes Protein.16
2.3.4 Elastin-bindendes Protein.17
2.3.5 Mikrokapsel-Gene.17
2.3.6 Hämolysine.19
2.3.6.1 Alpha-Toxin.19
2.3.6.2 Beta-Toxin.20
2.3.7 Enterotoxin.21
2.3.8 Superantigen-like-Protein.28
2.3.9 Toxic-Shock-Syndrome-Toxin-1.29
2.3.10 Exfoliative Toxine.31
3 MATERIAL UND METHODEN.33
3.1 Bakterienkulturen.33
3.1.1 Feldisolate.33
Inhaltsverzeichnis_[j.
3.1.2 Referenzstämme.36
3.2 Anzüchtungsmedien und Konservierung der Kulturen.36
3.2.1 Anzüchtungsmedien.36
3.2.2 Konservierung der S. aweus-lsolate.37
3.3 Identifizierung der ausgewählten S. aureus-Kulturen.38
3.3.1 Phänotypische Identifizierung.38
3.3.1.1 Hämolyseformen.38
3.3.1.2 Wachstum auf Baird-Parker-Agar.39
3.3.1.3 Nachweis der Koagulasereaktion.39
3.3.1.4 Nachweis des Clumping-Faktors.40
3.3.1.5 Identifizierung mittels MASTASTAPH-Kit.40
3.3.1.6 Weitere Enzymnachweise.41
3.3.1.6.1 DNase.41
3.3.1.6.2 Hyaluronidase.41
3.3.2 Biotypisierung.42
3.3.2.1 Nachweis der Koagulation von bovinem Plasma.42
3.3.2.2 Wachstum auf Kristallviolett-Agar.42
3.4 Auswahl derS. aureus-Kulturen.43
3.4.1 Makrorestriktionsanalyse der chromosomalen DNA
mittels Pulsfeldgelektrophorese.43
3.4.1.1 Präparation und Restriktionsverdau der Gesamtzeil-DNA.43
3.4.1.2 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE).44
3.4.1.3 Ethidiumbromidfärbung.45
3.4.1.4 Auswertung der PFGE-Muster.45
3.4.2 Molekularbiologische Identifizierung und weitergehende
Untersuchung.45
3.4.2.1 Präparation der bakteriellen DNA.45
3.4.2.1.1 Vereinfachte Präparation der bakteriellen DNA.45
3.4.2.1.2 DNA-Präparation mit dem Qiagen Tissue Kit.46
3.4.2.2 Durchführung der Polymerasekettenreaktion (PCR).46
3.4.2.2.1 Oligonukleotidprimer.47
3.4.2.2.2 Agarosegelelektrophorese.47
3.4.2.2.3 Ethidiumbromidfärbung.48
3.4.2.3 Koagulase-Gen-Polymorphismus.48
Inhaltsverzeichnis
3.4.2.4 Nachweis von Enterotoxingenen und weiteren
Superantigen-kodierenden Genen mittels „Multiplex-PCR".48
3.5 Analyse der mRNA-Expression mittels Reverser
Transkriptions-PCR.55
3.5.1 Präparation der bakteriellen Gesamt-RNA.55
3.5.2 Durchführung der Reversen Transkriptions-PCR.56
3.6 Statistische Auswertung.57
4 ERGEBNISSE.59
4.1 S. au/eus-ldentifizierung.59
4.1.1 Koagulaseaktivität.59
4.1.2 Nachweis des Thermonuklease-Gens (nuc).59
4.1.3 Nachweis des Koagulase-(coa) und des Protein A-Gens (spa).60
4.2 Phänotypische Hämolyse.60
4.3 Ergebnisse der Makrorestriktionsanalyse.60
4.4 Ergebnisse der Untersuchung des Koagulase-Gen-
Polymorphismus.63
4.5 Ergebnisse der Untersuchung des Protein A-Gen-
Polymorphismus.66
4.6 Zusammenfassung der Genotypisieaing.68
4.7 Ergebnisse der phänotypischen Charakterisierung.71
4.7.1 Hämolyseformen.71
4.7.2 Wachstum auf Baird-Parker-Agar.71
4.7.3 Clumping Faktor.72
4.7.4 Untersuchung mittels MASTASTAPH-Testkit.72
4.7.5 DNase.72
4.7.6 Hyaluronidase.72
4.8 BJotypisierung.73
4.9 Nachweis S. aureus-spezifischer Gene bzw. Genabschnitte
mittels PCR.74
4.9.1 Nachweis des S. aureus-spezifischen Abschnitts
des 23S rRNA-Gens.74
4.9.2 Nachweis des Clumping-Factor-Gens.75
4.10 Nachweis von mutmaßlichen Virulenzfaktorgenen.76
Inhaltsverzeichnis
4.10.1 IgG-bindende-Region kodierender Teil des
Protein A-Gens spa.76
4.10.2 Second IgG-binding Protein.77
4.10.3 Anheftungsfaktoren kodierende Gene.77
4.10.3.1 Fibronektin-bindendes Protein A und B.78
4.10.3.2 Kollagen-bindendes Protein.79
4.11 Elastin-bindendes Protein.82
4.12 Ergebnisse der Untersuchung auf Mikrokapsel-Gene.83
4.13 Hämolysin-Gene.85
4.14 Leukotoxin (luk E/D).89
4.15 Ergebnisse des Nachweises von Enterotoxin-Genen.90
4.15.1 Nachweis der Enterotoxin-Gene sea, seb, sed und see.90
4.15.2 Nachweis der Enterotoxingene sec und tst.93
4.15.3 Nachweis der Enterotoxine seg, seh, sei, sej und
des 16SrDNA-Gens.95
4.15.4 Nachweis der Enterotoxingene sem, sen, seo und
des Superantigen-like-Protein kodierenden Gens ssl7.99
4.16 Nachweis der Gene der Exfoliativen Toxine.105
4.17 Ergebnisse der explorativen statistischen Auswertung.106
4.18 Analyse der mRNA-Expression mittels RT-PCR.108
4.19 Ergebnisse des genotypischen Nachweises
von Resistenzdeterminanten.113
5 DISKUSSION.115
5.1 S. aureus-ldentifizierung.115
5.2 Hämolysenachweis.116
5.3 Restriktionsverdau der Gesamtzell-DNA.117
5.4 Weiterführende Untersuchung ausgewählter S. aureus-Stämme.121
5.4.1 Phänotypische Charakterisierung ausgewählter S. aureus-lsolate.121
5.4.2 Biotypisierung.123
5.4.3 Nachweis S. aweus-spezifischer Gene mittels PCR.123
5.4.4 Nachweis von mutmaßlichen Virulenzfaktorgenen mittels PCR.124
5.5 Reverse Transkriptions-PCR.131
5.6 Antibiotische Resistenzgene.132
Inhaltsverzeichnis_v_
5.7 Beurteilung der phänotypischen und genotypischen Marker.134
6 ZUSAMMENFASSUNG.136
7 SUMMARY.138
8 LITERATURVERZEICHNIS.140
9 DANKSAGUNG.181
10 ANHANG.182
Tabellenverzeichnis_V{_
TABELLENVERZEICHNIS
Tab. 1: Übersicht der verwendeten Oligonukleotidprimer,
und Thermocyclerprogramme, der erwarteten Amplikongrößen
sowie der Referenzliteratur.52
Zusammensetzung des Reaktionsgemisches zur Durchführung
derRT-PCR.56
Größe und Häufigkeit der Amplifikate bzw. der
Restriktionsfragmente der Koagulase-Gen-PCR.64
Häufigkeit der ermittelten Protein A-Typen.67
Beziehung zwischen Genotyp und Herkunft der S. aureus-lsolate.69
Zusammenfassende Darstellung der 61 S. aoreus-Typen.70
Hämolyseformen der 76 untersuchten S. aureus-Kulturen.71
Ergebnisse der phänotypischen Untersuchung der ausgewählten
S. aureus-lsolate (n = 76).72
Merkmale der ermittelten sieben Biotypen.73
Statistische Korrelation von epidemiologischem
Verhalten, Hämolyseverhalten und Biotyp der 76 S. aureus-
lsolate mit dem Nachweis verschiedener Anheftungsfaktor-Gene.81
Statistische Korrelation zwischen durchschnittlicher Zellzahl
(Betrieb, Viertel), durchschnittlicher Anzahl an Repeats (coa, spa)
und dem Nachweis verschiedener Anheftungsfaktor-Gene.81
Statistische Korrelation zwischen epidemiologischem
Verhalten, Hämolyseverhalten, Biotypisierung und dem Nachweis
der Kapselgene cap5 und cap8.84
Statistische Korrelation zwischen durchschnittlicher Zellzahl
(Betrieb, Viertel), durchschnittlicher Anzahl an Repeats (coa, spa)
und dem Kapselgen-Nachweis cap5 und cap8.85
Zusammenhang zwischen dem Auftreten verschiedener
Hämolysin-Gene, dem epidemiologischen Verhalten, der
Hämolyse und dem Biotyp.88
Zusammenhang zwischen dem Auftreten der Hämolysin-Gene
und der durchschnittlichen Zellzahl (Betrieb/Viertel) bzw. der
durchschnittlichen Anzahl von Repeats (coalspa).88
lab. 2:
Tab. 3:
Tab. 4:
Tab. 5:
Tab. 6:
Tab. 7:
Tab. P?
Tab. 9:
Tab. 10
Tab. 11
Tab. 12:
Tab. 13:
Tab. ' 14:
Tab. 1 15:
Tabellenverzeichnis VII
Tab. 16: Zusammenhang zwischen dem Auftreten verschiedener Enterotoxin-
und weiterer Toxin-Gene, dem epidemiologischen Verhalten,
dem Hämolyseverhalten und dem Biotyp.102
Tab. 17a. b: Zusammenhang zwischen dem Auftreten verschiedener
Enterotoxin- und weiterer Toxin-Gene und der durchschnittlichen
Zellzahl (Betrieb/Viertel) bzw. der durchschnittlichen Anzahl
von Repeats (coa/spa).104
Tab. 18: Vergleich von PCR- und RT-PCR-Ergebnissen zum Nachweis
der Gene sec, tst, seg, sei, sem, sen, seo, fnb/K,
und luk E/D.112
Tab. 19: Nachweis der Resistenzgene mecA und blaZ bei den
verschiedenen epidemiologischen Gruppen.113
Tab. 20: Schema zur Beurteilung von PFGE-Gelen nach TENOVER
et al. (1995).119
Abbildungsverzeichnis_VIM
ABBILDUNGSVERZEICHNIS Seite
Abb. 1: Vorauswahl der 76 untersuchten S. aureus-Feldisolate und
weiterführendeUntersuchungen.35
Abb. 2: Typisches Amplikon des nuc-Gens.59
Abb. 3: Makrorestriktionsanalyse von 9 S. aureus-Kulturen aus dem
Betrieb Nr. 23.61
Abb. 4: Makrorestriktionsanalyse von sieben S. aureus-Kulturen
aus dem Betrieb Nr. 29.62
Abb. 5: Typische Amplikons des Koagulase-Gens coa von 10
S. aureus-Kulturen.65
Abb. 6: Fragmente der Koagulase-Gen-Amplifikate von sechs Isolaten
aus Betrieb Nr. 5 nach Verdau mit dem Restriktionsenzym Alu\.65
Abb. 7: Fragmente von acht Koagulase-Gen-Amplifikaten
aus Betrieb Nr. 18 nach Restriktionsverdau mit/Vul.66
Abb. 8: Typische Amplikons des die X-Region kodierenden Teils des
Protein A-Gens spa von 11 S. aureus-Kulturen.67
Abb. 9: Typisches Amplikon des S. aureus-spezifischen Abschnitts
des 23S rRNA-Gens.74
Abb. 10: Amplikons des Clumping-Factor-Gens.75
Abb. 11: Typische Amplikons des die IgG-bindende Region kodierenden
Teils des Protein A-Gens spa von fünf S. aweus-lsolaten (Feldisolate).76
Abb. 12: Typisches Amplikon des sb/-Gens von vier S. aureus-Kulturen.77
Abb. 13: Amplikons des FnBp-kodierenden Gens fnbA einiger
S. aureus-Kulturen.78
Abb. 14: Amplikons des FnBp-kodierenden Gens fnbB einiger
S. aureus-Kulturen.79
Abb. 15: Typische Amplikons des Abschnitts A des CNA-kodierenden
Gens cnaA einiger S. aureus-Kulturen.80
Abb. 16: Typische Amplikons des Abschnitts B des CNA-kodierenden
Gens cnaB einiger S. aureus-Kulturen.80
Abb. 17: Typische Amplikons des Gens ebpS einiger S. aureus-Kulturen.82
Abb. 18: Amplikons des Polysaccharidkapsel Typ 5-kodierenden
Gens cap5 einiger S. aureus-Kulturen.83
Abb. 19: Amplikons des Polysaccharidkapsel Typ 8-kodierenden
Abbildungsverzeichnis IX
Gens cap8 einiger S. aureus-Kulturen.84
Abb. 20: Typische Amplikons des Gens hla einiger S. aureus-Kulturen.86
Abb. 21: Typische Amplikons des Gens hlb einiger S. aureus-Kulturen.86
Abb. 22: Typische Amplikons des Gens hld einiger S. aureus-Kulturen.87
Abb. 23: Amplifikate des Gens hlg einiger S. aureus-Kulturen.87
Abb. 24: Ergebnisse der Amplifizierung des luk E/D Gens von
vier S. aureus-lsolaten.89
Abb. 25: „Multiplex-PCR" zum Nachweis der Gene sea, seb, sed und see.91
Abb. 26: Typische Amplikons des Enterotoxin D-kodierenden Gens
sed einiger S. aureus-Kulturen.92
Abb. 27: Typische Amplikons des Enterotoxin E-kodierenden Gens see
einiger S. aureus-Kulturen.92
Abb. 28: „Multiplex-PCR" zum Nachweis der Gene sec und tst.93
Abb. 29: Typische Amplikons des sec-Gens von zwei .epidemischen"
S. aureus-Feldisolaten.94
Abb. 30: Typische Amplikons des fsf-Gens von zwei „sporadischen"
S. aureus-Feldisolaten.94
Abb. 31: „Multiplex-PCR" zum Nachweis der Gene seg, seh, sei, sej
und des 16S rDNA-Gens von S. aureus.96
Abb. 32: Typische Amplikons des Enterotoxin H-kodierenden
Gens seh einiger S. aureus-Kulturen.97
Abb. 33: Typische Amplikons des Enterotoxin G-kodierenden Gens
seg einiger S. aureus-Kulturen.97
Abb. 34: Typische Amplikons des Gens sei von zwei „epidemischen"
S. aureus-Feldisolaten.98
Abb. 35: Typische Amplikons des Gens sej von zwei „epidemischen"
S. aureus-Feldisolaten.98
Abb. 36: Typische Amplikons des Enterotoxin M-Gens sem von
drei S. auret/s-Feldisolaten.100
Abb. 37: Typische Amplikons des Enterotoxin N-Gens sen von drei
S. aureus-Feldisolaten.100
Abb. 38: Typische Amplikons des Enterotoxin O-Gens seo von zwei
S. aureus-Feldisolaten.101
Abb. 39: Typische Amplikons des Superantigen-like-Protein kodierenden
Abbildungsverzeichnis X
Gens ssl7 einiger S. aureus-Feldisolate.101
Abb. 40: Amplikons der Exfoliativen Toxin-Gene eta und etb von
S.aureus 114/98.105
Abb. 41: Typisches Ergebnis der PCR mit den Oligonucleotidprimem
nucA-1 und nucA-2 zur Kontrolle der DNA-Kontamination nach
der RNA-Extraktion ohne RT-Schritt.108
Abb. 42: Typische Amplikons der transkribierten sec-, tst-, seg- und sef-Gene
von S. aureus-Referenzstämmen mittels RT-PCR.109
Abb. 43: Typische Amplikons der transkribierten sem-, sen- und
seo-Gene eines S. aureus-Referenzstammes mittels RT-PCR.110
Abb. 44: Typisches Amplikon des transkribierten fnbA-Gens des
S. aureus-Referenzstammes ATCC 25923 mittels RT-PCR.111
Abb. 45: Typisches Amplikon des transkribierten Leukotoxin E/D-Gens
des S. aureus-Referenzstammes ATCC 25923 mittels RT-PCR.111
Abb. 46: Typische Amplikons des 6/aZ-Gens.114
Abb. 47: Typisches Amplikon des mecA-Gens.114
Abb. 48: Schema zu Funktionsweise der PFGE (CHEF-System) nach
LAIetal. (1989).118 |
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