Herstellung von kaninem Interleukin-2 (cIL-2) nach stabiler Transfektion der mesenchymalen BHK-Zelllinie mit Hilfe des Tet-on-Expressionssystems zur Erzeugung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) für eine adoptive Tumorimmuntherapie beim Hund:
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
Gießen
VVB Laufersweiler
2008
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Ausgabe: | 1. Aufl. |
Schriftenreihe: | Edition scientifique
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Schlagworte: | |
Online-Zugang: | Abstract Inhaltsverzeichnis |
Beschreibung: | III, 187 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURUEBERSICHT 3
2.1 TUMORIMMUNTHERAPIE 3
2.1.1 ADOPTIVE TUMORIMMUNTHERAPIE MIT IL-2 UND LYMPHOKIN-AKTIVIERTEN
KILLERZEILEN (LAK) BEIM MENSCHEN 4
2.1.2 ADOPTIVE TUMORIMMUNTHERAPIE BEIM HUND 7
2.2 INTERLEUKIN-2 (IL-2) 9
2.2.1 CHARAKTERISTIKA DES GENS UND DES PROTEINS 9
2.2.2 IL-2-REZEPTOR 10
2.2.3 WIRKUNG VON IL-2 11
2.3 LYMPHOZYTENANREICHERUNG 12
2.4 STIMULATION VON KANINEN LYMPHOZYTEN 13
2.5 PROLIFERATIONSTEST MIT METHYLTHIAZOL-TETRAZOLIUM (MTT) 14
2.6 RT-PCRZUR AMPLIFIKATION EINER COPY-DNA (CDNA) VON CIL-2 16
2.7 TETRAZYKLINABHAENGIGE EXPRESSION VON GENEN I7
2.7.1 DAS TET-OFF-EXPRESSIONSSYSTEM 18
2.7.2 DAS TET-ON-EXPRESSIONSSYSTEM 20
2.7.3 VERWENDETE REGULATOR- UND RESPONSE-PLASMIDE 22
2.7.4 EMPFAENGERZELLEN DES TET-ON-SYSTEMS 23
2.8 IL-2-BIOASSAY 24
2.9 ROSE BENGAI ASSAY (RBA) 25
3 MATERIAL UND METHODEN 27
3.1 GEWINNUNG DER IL-2-SEQUENZ 27
3.1.1 BLUTENTNAHME UND LYMPHOZYTENISOLIERUNG MITTELS EINSTUFIGER
PERCOLL*- DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 27
MITOGEN-STIMULATION DER LYMPHOZYTEN 28
UEBERPRUEFUNG DER STIMULATION MIT DER MTT-PROLIFERATIONSMESSMETHODE 29
GEWINNUNG DER MRNA 30
RT-PCR 31
1.5.1 DNASE-BEHANDLUNG 31
.5.2 AUSWAHL DER PRIMER 32
.5.3 REVERSE TRANSKRIPTASE-REAKTION 33
.5.4 KONVENTIONELLE PCR 33
.5.5 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 34
.5.6 SEQUENZIERUNG DES RT-PCR-PRODUKTES 35
.6 KLONIERUNG DES RT-PCR-PRODUKTES 35
.6.1 NAEHRMEDIEN UND BAKTERIENSTAMM 37
3.1.6.2 KLONIERUNGSREAKTION 37
.6.3 RESTRIKUEONSENZYMVERDAU 38
6.4 REKJONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES PLASMIDS 39
3. 3. 3.2 TET-ON-EXPRESSION 39
3.2.1 EINBAU VON RE.STRIKTIONSSCHNITTSTELLEN IN DAS CIL-2-GEN 39
3.2.1.1 PRIMER UND PCR-BEDINGUNGEN 39
3.2.1.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 40
3.2.1.3 ISOLIERUNG DES DNA-FRAGMENTES 41
3.2.2 AMPLIFIZIERUNG DES REPORTERGENS LUCIFERASE UND DER IRES 41
3.2.3 KLONIERUNG UND ANALYSE BEIDER PCR-FRAGMEME 42
3.2.3.1 LIGATION 42
3.2.3.2 TRANSFORMATION DER PGEM-T-VEKTOREN IN F.. COLI K12 DH5A 43
3.2.3.3 MINI-PRAEPARATION DER PLASMIDE PGEM-T-IL2 UND PGEM-T-IRES AUS
BAKIERIENKULTUREN 44 3.2.3.4 ANALYTISCHER VERDAU DER PLASMIDE PGEM-T-IL2
UND PGEM-T-IRES 44
3.2.3.5 RETRANSFORMATION AUSGEWAEHLTER PGEM-T-KLONE 45
3.2.3.6 MIDI-PRAEPARATION DER PLASMID-DNA AUS BAKTERIENKULTUREN UND
DNA-KONZENTRATIONSBES!IMMUNG 45
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/992383722
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.4 SEQUENZIERUNG DES PGEM-T-IL2-#L-KIONS 46
3.2.4.1 SEQUENZIERANSATZ 47
3.2.4.2 SEQUENZIERGEL UND AUSWERTUNG DER SEQUENZ 47
3.2.5 ZUSAMMENBAU DES PLASMIDES PTRUE-IL2-IRES 48
3.2.5.1 RESTRIKTIONSENZYMVERDAU 49
3.2.5.2 DEPHOSPHORYLIERUNG UND PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION DES
LINEARISIERTEN VEKTORS PTRUE 51
3.2.5.3 DREIFACHLIGATION 51
3.2.6 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON PTRUE-IL-2-IRES IN BHK-TET-ON-ZELLEN
UND FUNKTIONEILE UEBERPRUEFUNG DES REPORTERGENS LUCIFERASE 53
3.2.6.1 ZELLKULTURARBEITEN MIT BHK-TET-ON-ZELLEN ZUR VORBEREITUNG DER
TRANSFEKTION 55
3.2.6.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION MIT METAFECTENE* 55
3.2.6.3 LUCIFERASE-ASSAY ZUR UEBERPRUEFUNG DES REPORTERGENS 56
3.2.6.4 LUCIFERASE-ASSAY AM LUMINOMETER 57
3.2.7 STABILE TRANSFEKTION VON PTRUE-IL-2-IRES IN BHK-TET-ON-ZELLEN ZUR
ERZEUGUNG EINER IL-2-PODUZIERENDEN ZELLLINIE 57
3.2.7.1 ZELLKULTURARBEITEN MIT BHK-TET-ON-ZELLEN ZUR VORBEREITUNG DER
TRANSFEKTION 57
3.2.7.2 LINEARISIERUNG UND AUFREINIGUNG DES PLASMIDS PTRUE-IL-2-IRES 58
3.2.7.3 STABILE TRANSFEKTION MIT METAFECTENE* 1 58
3.2.7.4 KLONIERUNG DER TRANSFIZIERTEN ZELLEN 59
3.2.7.5 LUCIFERASE-ASSAY UND AUSWAHL DER KLON-KOLONIEN 60
3.2.7.6 REKLONIERUNG 60
3.2.8 KRYOKONSERVIERUNG DER GEWONNENEN ZELL-KLONE 60
3.3 RT-PCR ZUM NACHWEIS DERCIL2-MRNA IN DEN TRANSFIZIERTEN BHK-ZELLEN 61
3.3.1 VORBEREITUNG UND INDUKTION DER TRANSFIZIERTEN BHK-ZELLEN 61
3.3.2 RNA-PRAEPARAUEON UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 62
3.3.3 ABLAUF DER RT-PCR 63
3.3.3.1 DNASE-VORBEHANDLUNG 63
3.3.3.2 DENATURIERUNG 64
3.3.3.3 CDNA-SYNTHESE 64
3.3.3.4 PCR 65
3.3.3.5 AGAROSE-GELEKTROPHORESE 66
3.4 EINFLUSS DER UEBERSTAENDE VON NICHT TRANSFIZIERTEN BHK-ZELLEN AUF DIE
SPONTANE ZYTOLOXISCHE AKTIVITAET VON EFFEKTORZELLEN 66
3.4.1 TESTPRINZIP DES RBA 66
3.4.1.1 ZIELZELLLINIE CTAC 66
3.4.1.2 GEWINNUNG UND VORBEREITUNG DER NK-EFFEKTORZELLEN 67
3.4.1.2.1 EFFEKTORZELLISOLIERUNG 67
3.4.1.2.2 GEWINNUNG DER BHK-TESTUEBERSTAENDE 67
3.4.1.2.3 VORBEHANDLUNG FUER 12 STUNDEN 68
3.4.2 DURCHFUEHRUNG DES ROSE BENGAL ASSAYS (RBA) 68
3.4.2.1 VORBEREITUNG DER CTAC-ZIELZELLEN 68
3.4.2.2 TESTANSATZ 68
3.4.2.3 ROSE BENGAL FAERBUNG 69
3.4.2.4 BERECHNUNG DER ZYTOTOXIZITAET 70
3.5 QUANTIFIZIERUNG DES SEZERNIERTEN REKOMBINANTEN KANINEN LMERLEUKIN-2
IM BIOASSAY (MTT-TEST) 70
3.5.1 IL-2-BIOASSAY MIT CTLL-2-ZELLEN 70
3.5.1.1 CTLL-2-ZEL!LINIE 70
3.5.1.2 PRINZIP DES BIOASSAYS 72
3.5.1.2.1 BHK-KULTURUEBERSTAENDE 72
3.5.1.2.2 ANSATZ DES BIOASSAYS 73
3.5.2 VERSCHIEDENE VERSUCHSANSAETZE DES BIOASSAYS 74
3.5.2.1 DAS STANDARD-BIOASSAY 74
3.5.2.2 KOINKUBATION VON CTLL-2-ZELLEN UND TRANSFIZIERTEN BHK-ZELLEN IN
TRANSWELL*-EINSAETZEN 74
3.5.2.3 ZUSAETZLICHE BIOASSAYS 76
3.5.2.3.1 ZEITLICHER VERLAUF DER RCIL-2-PRODUKTION UEBER 72 H 76
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS III
3.5.2.3.2 RCIL-2-PRODUKTION IN SERUMFREIEM KULTURMEDIUM 76
3.5.2.3.3 INDUKTION DURCH VERSCHIEDENE DOXYZYKLIN-KONZENTRATIONEN 77
3.5.3 BERECHNUNG DER RCIL-2-KONZENTRATION 77
4 ERGEBNISSE 80
GEWINNUNG DER CDNA FUER CIL-2 . 1 LYMPHOZYTENISOLIERUNG UND STIMULATION
80
.2 GEWINNUNG DER TOTAL-RNA 81
.3 RT-PCR ZUR GEWINNUNG DER CDNA 82
.4 SEQUENZIERUNG DES RT-PCR-PRODUKTES 83
4.1.5 KLONIERUNG DES RT-PCR-PRODUKTES 85
4.1.6 SEQUENZIERUNG DES KLONIERTEN RT-PCR-FRAGMENTES 85
4.2 TET-ON-EXPRESSION 88
4.2.1 EINBAU VON RESTRIKTIONSENZYMSCHNITTSTELLEN DURCH PCR IN CIL-2 88
4.2.2 ANALYSE DER CIL-2- UND IRES-LUCIFERASE-FRAGMENTE 89
4.2.3 SEQUENZIERUNG DES PGEM-T-IL2#L-KLONS 91
4.2.4 ZUSAMMENBAU VON PTRUE-IL2-IRES 93
4.2.5 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON PTRUE-IL2-IRES IN BHK-TET-ON-ZELLEN 98
4.2.6 STABILE TRANSFEKTION VON PTRUE-IL2-IRES IN BHK-TET-ON-ZELLEN ZUR
ERZEUGUNG EINER CIL-2-PRODUZIERENDEN ZELLLINIE 99
4.2.7 RT-PCR ZUM NACHWEIS DER CIL-2-MRNA IN DEN TRANSFIZIERTEN
BHK-ZELLEN 102 4.3 EINFLUSS DER UEBERSTAENDE VON NICHT TRANSFIZIERTEN
BHK-ZELLEN AUF DIE SPONTANE ZYTOTOXISCHE AKTIVITAET (RBA) 104
4.4 QUANTIFIZIERUNG DES SEZERNIERTEN REKOMBINANTEN KANINEN IL-2 IM
BIOASSAY (MTT-TEST) 106 4.4.1 EINFLUSS UNTERSCHIEDLICH EINGESETZTER
BHK-ZELLKONZENTRATIONEN UND INKUBATIONSZEITEN 108 4.4.2 KOINKUBAUEON VON
TRANSFIZIERTEN BHK-LINIEN MIT CTLL-2-ZELLEN IN TRANSWELL-EINSAETZEN 111
4.4.3 ZEITLICHER VERLAUF DER RCIL-2-PRODUKTION UEBER 72 H 112
4.4.4 RCIL-2-PRODUKTION UNTER SERUMIREIEN BEDINGUNGEN 115
4.4.5 INDUKTION MIT VERSCHIEDENEN DOXYZYKIIN-KONZENTRATIONEN 117
5 DISKUSSION 118
6 ZUSAMMENFASSUNG ............................... . 129
7 SUMMARY 132
JT LITERATURVERZEICHNIS 135
9 ANHANG 149
9.1 TABELLEN 149
9.2 BEZUGSQUELLEN FUER CHEMIKALIEN 181
9.3 BEZUGSQUELLEN FUER GERAETE UND EINMALARTIKEL 184
9.4 LOESUNGEN UND PUFFER 186
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