Interaktionen von P II -Signaltransduktionsproteinen im Stickstoffmetabolismus der Organismen Bacillus subtilis und Synechococcus elongatus:
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2005
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EINLEITUNG
1
1.
BEDEUTUNG
DES
STICKSTOFFS
1
2.
DAS
PI-SYSTEM
2
2.1.
BIOCHEMIE
DER
PIRPROTEINE
3
2.2.
LIGANDENBINDUNG
4
2.3.
MODIFIKATION
6
2.4.
FUNKTIONSVIELFALT
DER
PI-PROTEINE
7
3.
BACILLUS
SUBTILIS
9
3.1.
SYSTEMATIK
UND
PHYSIOLOGIE
9
3.2.
STICKSTOFFREGULIERUNG
IN
B.
SUBTILIS
11
4.
CYANOBAKTERIEN
15
4.1.
VERBREITUNG
UND OEKOLOGISCHE
BEDEUTUNG
15
4.2.
STICKSTOFF-STOFFWECHSEL
15
4.2.1.
STICKSTOFF-ASSIMILATION
IN
SYNECHOCOCCUS
ELONGATUS
PCC
7942
16
4.2.2.
PN-SIGNALTRANSDUKTION
IN
CYANOBAKTERIEN
17
4.2.3.
CYANOPHYCIN
18
4.3.
ARGININ-BIOSYNTHESE
19
5.
ALLGEMEINE
FRAGESTELLUNG
21
5.1.
BACILLUS
SUBTILIS
GLNK
21
5.2.
SYNECHOCOCCUS
ELONGATUS
GLNB
21
B.
MATERIAL
UND
METHODEN
22
1.
BAKTERIENSTAEMME,
PLASMIDE
UND
OLIGONUKLEOTIDE
22
1.1.
BAKTERIENSTAEMME
22
1.2.
VEKTOREN
22
1.3.
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
25
2.
KULTIVIERUNG
VON
BAKTERIEN
26
2.1.
ESCHERICHIA
COLI
26
2.1.1.
NAEHRMEDIUM
UND
ANZUCHTBEDINGUNGEN
26
2.2.
BACILLUS
SUBTILIS
26
2.2.1.
NAEHRMEDIUM
26
2.2.2.
ANZUCHTBEDINGUNGEN
27
2.2.3.
ERNTEN
DER
ZELLEN
27
3.
PUFFER
UND
REAGENZIEN
28
3.1.
LAUFPUFFER
28
3.2.
AUFTRAGSPUFFER
28
3.3.
BLOTTING-PUFFER
FUER
SEMI-DRY-BLOT
29
3.4.
PUFFER
ZUR
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIENSTAEMME
29
3.5.
ZELLAUFBRUCHSPUFFER
30
3.6.
PUFFER
FUER
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
AUFTRENNUNGEN
31
3.7.
PUFFER
FUER
ENZYMAKTIVITAETSTESTS
33
3.8.
PUFFER
FUER
IMMUNOPRAEZIPITATION
33
3.9.
PUFFER
FUER
IN-GEL
TRYPSINVERDAU
34
3.10.
PUFFER
FUER
LIGANDENBINDUNGSTESTS/U
V-CROSSLINKING
34
3.11.
LAGERPUFFER
34
3.12.
FAERBELOESUNGEN
FUER
SDS-POLYACRYLAMIDGELE
35
3.13.
SONSTIGE
PUFFER
35
3.14.
STANDARDS
36
4.
ENZYME
UND
CHEMIKALIEN
36
5.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
36
5.1.
DNA-ISOLIERUNG
36
5.2.
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
37
5.3.
AMPLIFIKATION
VON
DNA
DURCH
POLYMERASEN-KETTEN-REAKTION
(PCR)
37
5.4.
DNA-AUFREINIGUNG
NACH
PCR
UND
ANDEREN
ENZYMATISCHEN
REAKTIONEN
(QIAQUICK
PCR
PURIFICATION
KIT,
QIAGEN)
38
5.5.
DNA-PRAEPARATION
AUS
AGAROSEGELEN
(QIAGEN,
QIAQUICK
GEL
EXTRACTION
KIT)
38
5.6.
RESTRIKTIONEN
39
5.7.
LIGATIONEN
39
5.8.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
39
5.9.
SEQUENZIERUNG
39
5.10.
TRANSFORMATIONSVERFAHREN
39
5.11.
HERSTELLUNG
VON
GLYCERIN-KULTUREN
40
5.12.
HERSTELLUNG
VON
RADIOAKTIV-MARKIERTER
DNA
(5
-ENDLABELLING)
41
6.
ANALYTISCHE
METHODEN
41
6.1.
BESTIMMUNG
DER
ZELLDICHTE
41
6.2.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
(NACH
BRADFORD)
41
6.3.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
42
II
7.
FAERBEMETHODEN
FUER
SDS-PAGES
43
7.1.
SILBERFAERBUNG
NACH
BLUM
ET
AL.,
1987
43
7.2.
COOMASSIE-FAERBUNG
44
7.3.
FAERBUNG
MIT
SYPRO
@
-ORANGE
(BIO-RAD)
44
8.
ZELLAUFBRUCHSMETHODEN
44
8.1.
ZELLAUFBRUCH
IM
RIBOLYSER
44
8.2.
ZELLAUFBRUCH
MITTELS
FRENCH-PRESS
45
9.
PROTEINFRAKTIONIERUNGSMETHODEN
45
9.1.
ZENTRIFUGATION
45
9.2.
AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG
45
9.3.
SS-MERCAPTOETHANOL-FAELLUNG
45
9.4.
PRAEPARATION
VON
MEMBRANFRAKTIONEN
46
10.
ENTSALZUNG
UND
UMPUFFERUNG
46
11.
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
46
11.1.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
47
11.2.
GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE
47
11.3.
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
47
11.4.
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
47
11.5.
STREP-TAG
PULLDOWN
ASSAY
47
12.
PROTEINAUFREINIGUNG
47
12.1.
REINIGUNG
VON
BACILLUS
SUBTILIS
TNRA
47
12.2.
REINIGUNG
VON
BACILLUS
SUBTILIS
GLNK-STREP-TAG
(GINK-ST)
48
12.3.
REINIGUNG
VON
SYNECHOCOCCUS
ELONGATUS
ARGB
(NAG-KINASE)
49
13.
BESTIMMUNG
DES
MOLEKULARGEWICHTES
49
13.1.
EICHUNG
DER
GELFILTRATIONSSAEULE
49
13.2.
GELFILTRATION
VON
PROTEINEN
50
14.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
50
14.1.
IMMUNOBLOTANALYSE
[WESTERN
BLOT)
51
14.2.
DOT
BLOT-METHODE
52
14.3.
IMMUNOPRAEZIPITATION
52
15.
TRYPTISCHER
IN-GEL
VERDAU
53
16.
MASSENSPEKTROSKOPIE
(MALDI-TOF)
54
17.
ELEKTROSPRAY-IONISIERUNGSMASSENSPEKTROMETRIE
(ESI-MS)
55
III
18.
LIGANDENBINDUNG
-
UV-CROSSLINK
MIT
ATP/ADP
AN
GINK
55
19.
GELSHIFT-EXPERIMENTE
56
20.
ENZYMAKTIVITAETSTESTS
56
20.1.
GLUTAMIN-SYNTHETASE
(BIOSYNTHETISCHER
TEST)
56
20.2.
N-ACETYL-L-GLUTAMAT-KINASE
(NAG-KINASE)
57
21.
BIACORE
SURFACE
PLASMON
RESONANCE
DETECTION
58
C.
ERGEBNISSE
59
I.
BACILLUS
SUBTILIS
GINK
59
1.
BIOCHEMISCHE
UND
PHYSIOLOGISCHE
EIGENSCHAFTEN
DES
B.
SUBTILIS
GLNK-PROTEINS
59
1.1.
BINDUNG
VON
LY-32PATP
UND
[8
14
C]ADP
AN
GINK
59
1.2.
ZELLULAERE
LOKALISATION
VON
B.
SUBTILIS
GINK
61
1.3.
MODIFIZIERUNG
VON
B.
SUBTILIS
GINK
63
1.3.1.
AUFREINIGUNG
VON
NATIVEM
GINK
AUS
B.
SUBTILIS
64
1.3.2.
AUFREINIGUNG
VON
UEBERPRODUZIERTEM
GLNK-ST
IN
B.
SUBTILIS
UND
E.
COLI
68
1.3.2.1.
AUFREINIGUNG
VON
GLNK-ST
AUS
B.
SUBTILIS
68
1.3.2.2.
AUFREINIGUNG
VON
GLNK-ST
AUS
E.
COLI
70
1.3.3.
ELEKTROSPRAY-IONISIERUNGSMASSENSPEKTROMETRIE
(ESI-MS)
73
1.3.4.
IMMUNOPRAEZIPITATION
VON
B.
SUBTILIS
GINK
UND
MASSENSPEKTROSKOPIE
74
2.
INTERAKTION
ZWISCHEN
TNRA
UND
GINK
IN
B.
SUBTILIS
76
2.1.
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PT7-TNRA
76
2.2.
UEBEREXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
VON
TNRA
77
2.2.
GEL
ELECTROPHORETIC
MOBILITY
SHIFT
ASSAY
(GEMSA)
81
2.3.
CO-IMMUNOPRAEZIPITATION
VON
TNRA
UND
GINK
84
2.4.
CO-LOKALISATION
VON
TNRA
UND
GINK
86
2.5.
ATP/A-KETOGLUTARAT-EFFEKT
AUF
DEN
GLNK-TNRA-KOMPLEX
88
2.6.
TNRA-LOKALISATION
IN
ABWESENHEIT
VON
STICKSTOFF
89
2.7.
KLONIERUNG
EINER
GIN
H-DEFIZIENTEN
MUTANTE
90
3.
INTERAKTION
ZWISCHEN
TNRA
UND
GLUTAMIN-SYNTHETASE
92
3.1.
KONSTRUKTION
DES
VEKTORS
PET-TNRA
92
3.2.
TNRA
BEEINFLUSST
DIE
GLUTAMIN-SYNTHETASE-AKTIVITAET
DURCH
PROTEIN-INTERAKTION
93
II.
SYNECHOCOCCUS
ELONGATUS
N-ACETYL-L-GLUTAMAT-KINASE
100
1.
AUFREINIGUNG
100
2.
KOMPLEXBILDUNG
ZWISCHEN
PI
UND
NAG-KINASE
105
IV
106
3.
PI
BEEINFLUSST
DIE
NAG-KINASE
AKTIVITAET
4.
EIGENSCHAFTEN
DES
NAG-KINASE-PI-KOMPLEXES
4.1.
BESTIMMUNG
DES
MOLEKULARGEWICHTES
4.2.
EFFEKT
DER
PILIGANDEN
A-KETOGLUTARAT
UND
ATP
AUF
DIE
KOMPLEXBILDUNG
4.3.
DIE
ROLLE
DES
PU
SERIN
49
IN
DER
NAG-KINASE-PIRINTERAKTION
4.4.
FEEDBACK-HEMMUNG
DER
NAG-KINASE-AKTIVITAET
DURCH
ARGININ
UND
DEREN
PARTIELLE
AUFHEBUNG
DURCH
KOMPLEXBILDUNG
MIT
PI
108
108
111
113
115
D.
DISKUSSION
117
1.
BACILLUS
SUBTILIS
117
2.
SYNECHOCOCCUS
ELONGATUS
127
E.
ZUSAMMENFASSUNG
1.
BACILLUS
SUBTILIS
134
134
2.
SYNECHOCOCCUS
ELONGATUS
134
F.
LITERATURANGABE
135
G.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
150
DANKSAGUNG
154
V
|
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