Charakterisierung von Herpesviren bei Spendertieren für die Xenotransplantation: Identifikation von funktionalen Regulatorproteinen des porzinen lymphotropen Herpesvirus Typ-1 (PLHV-1)
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
Mensch & Buch
2007
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Biology
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 197 S. Ill., graph. Darst. |
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IMAGE 1
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
2. LITERATURUEBERSICHT 2
2.1 ORGANMANGEL - DIE SUCHE NACH ALTERNATIVEN ZUR ALLOTRANSPLANTATION 2
2.2 XENOTRANSPLANTATION 3
2.2.1 IMMUNOLOGISCHE HUERDEN IN DER XENOTRANSPLANTATION 5
2.2.2 VIREN - EIN RISIKO BEI DER XENOTRANSPLANTATION 6
2.3 DIE FAMILIE HERPESVIRIDAE 9
2.3.1 STRUKTUR UND MORPHOLOGIE VON HERPESVIREN 11
2.3.2 DER HERPESVIRALE VERMEHRUNGSZYKLUS 13
2.4 PORZINE LYMPHOTROPE HERPESVIREN (PLHV) 15
2.4.1 GENOMSTRUKTUR DER PLHV 17
2.5 HERPESVIRALE PROTEINE DER IMMEDIATE EARFY-GENEXPRESSION 21
2.5.1 PLHV-1 ORF50. 21
2.5.1.1 ORF50-HOMOLOGE PROTEINE IN EBV UND HHV-8 23
2.5.2 PLHV-1 ORFA6/BZLF1* 24
2.5.2.1 ORFA6/BZLF1*-HOMOLOGE PROTEINE IN EBV UND HHV-8 26
2.5.3 PLHV-1 ORF57. 28
Z5.3.1 HERPESVIRALE ORF57-HOMOLOGE PROTEINE 29
2.6 ZIELE DER ARBEIT 30
3. MATERIAL 32
3.1 GEWEBE 32
3.2 ZELLEN 32
3.3 BAKTERIEN 32
3.4 NUKLEINSAEUREN 33
3.5 ENZYME, DNA-MARKER UND ANTIKOERPER 36
3.5.1 ENZYME 36
3.5.2 MARKER 37
3.5.3 ANTIKOERPER 37
3.6 VEKTOREN 37
3.7 REAGENZIENSAETZE (KITS) 37
3.8 CHEMIKALIEN UND BIOCHEMIKALIEN 38
3.9 PUFFER UND LOESUNGEN 39
GESCANNT DURCH
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/987696238
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.1 0 GERAETE UND LABORHILFSMITTEL 44
3.11 VERBRAUCHSMATERIALIEN 46
3.12 SOFTWARE 46
4. METHODEN 47
4.1 GENTECHNOLOGISCHE METHODEN 47
4.1.1 PRAEPARATION VON NUKLEINSAEUREN 47
4.1.1.1 EXTRAKTION VON DNA AUS ZELLKULTURZELLEN 47
4.1.1.2 PRAEPARATION VON RNA AUS ZELLKULTURZELLEN 47
4.1.1.3 ISOLATION VON PLASMID-DNA 48
4.1.1.3.1 MINIPRAEPARATION 48
4.1.1.3.2 MAXIPRAEPARATION 49
4.12 HYBRIDISIERUNG 50
4.13 REVERSE TRANSKRIPTION 50
4.1.4 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 51
4.1.4.1 NESTED-PCR 52
4.1.4.2 RACE-PCR 53
4.1.4.3 REAL TIME-PCR 55
4.1.4.3.1 STANDARDISIERUNG 56
4.1.4.3.2 NORMALISIERUNG 57
4.1.4.3.3 DETEKTION VON PLHV-3 UND EBV 58
4.1.4.3.4 NORMALISIERUNG UND AUSWERTUNG DER TAQMAN-DATEN 59
4.15 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 60
4.16 AUFREINIGUNG VON PCR-FRAGMENTEN 61
4.1.6.1 AUFREINIGUNG MIT DEM QIAQUICK PCR PURIFICATION KIT 61
4.1.6.2 EXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN 61
4 . 17 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION VON NUKLEINSAEUREN 62
4.1.7.1 MESSUNG DER OPTISCHEN DICHTE MITTELS ABSORPTIONSSPEKTROMETRIE 62
4.1.7.2 FLUORIMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 62
4.1.8 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN 62
4.1.8.1 DNA-RESTRIKTION 63
4.1.8.2 DEPHOSPHORYLIERUNG 64
4.1.8.3 DNA-UGATION 64
4.1.8.4 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN AE 5
4.1.8.5 SCREENING NACH POSITIVEN E. CO/A-KLONEN 65
4.1.9 HERSTELLUNG VON EXPRESSIONSPLASMIDEN 65
4.1.10 HERSTELLUNG DER REPORTERGENPLASMIDE 66
4.1.11 LAGERUNG VON E. COTI-KULTUREN 67
4.1.12 SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA 6" 7
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 68
4.2.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN 68
4.2.1.1 SUSPENSIONSZELLEN 68
4.2.1.2 ADHAERENT WACHSENDE ZELLEN 68
4.2.2 ZELLZAEHLUNG 69
4.2.3 LAGERUNG VON ZELLEN 69
4.2.4 TRANSFEKTION VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN 70
4.2.4.1 TRANSFEKTION MITTELS NICHT-LIPOSOMALER LIPIDE (EFFECTENE) 70
4.2.4.2 LIPOSOMENVERMITTELTE TRANSFEKTION (GENEPORTER*2) 71
4.2.4.3 TRANSFEKTION MITTELS ELEKTROPORATION 72
4.2.5 KOKUTTIVIERUNG VON L23- UND B95-8-ZELLEN 74
4.2.6 DURCHFLUSSZYTOMETRIE IFACS (FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTING)
74
4.2.7 LUZIFERASE-REPORTERGEN- UNDSS-GALACTOSIDASEASSAY. 75
4.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 77
4.3.1 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 77
4.3.1.1 HERSTELLUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN 77
4.3.1.2 PROBENVORBEREITUNG UND GELELEKTROPHORESE 78
4.3.2 WESTEMBLOT. 79
4.3.2.1 IMMUNOLOGISCHE DETEKTION VON PROTEINEN * 79
4.3.3 KOIMMUNPRAEZIPITATION (KO-IP) 80
4.3.4 IMMUNFLUORESZENZ (IFA) 82
4.3.5 KONFOKALE LASER-SCANMIKROSKOPIE (CLSM) 83
5. ERGEBNISSE - 84
5.1 METHODISCHE GRUNDLAGEN 84
5.1.1 KLONIERUNG IN EXPRESSIONSVEKTOREN 84
5.1.1.1 KONSTRUKTION VON ORF50-. ORFA6/BZLFV UND ORF57-EXPRESSIONS-
PLASMIDEN 84
5.1.1.2 KONSTRUKTION VON PLASMIDEN ZUR EXPRESSION VON ORF50-,
ORFA6/BZLFV
UND ORF57-FUSIONSPROTEINEN * *86
5.12 KLONIERUNG IN LUZIFERASE-REPORTERGENVEKTOREN 88
5.1.2.1 KLONIERUNG VON PLHV-1-PROMOTOREN .* * _._ * 88
5.1.2.2 KTONIERUNG VON EBV-PROMOTOREN 88
5.1.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR TRANSKRIPTION DER EXPRESSIONSPLASMIDE 91
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
5.2 VERSUCHSERGEBNISSE 93
5.2.1 EXPRESSION DER PLHV-1-PROTEINE ORF50, ORFA6/BZLFU UND
ORF57 93
5.2.2 SUBZELLULAERE LOKALISATION DER PLHV-1-PROTEINE ORF50, 0RFA6/BZLF1 H
UNDORF57 95
5.2.3 UNTERSUCHUNG DER TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET VON PLHV-1 ORF50,
ORFA6/BZLF1 HUNDORF57 98
5.2.3.1 VORVERSUCHE ZUR OPTIMIERUNG DES LUZIFERASE-REPORTERGENASSAY 98
5.2.3.1.1 EINFLUSS DER TEMPERATUR 98
5.2.3. 1.2 EINFLUSS DER TRANSFEKTIONSREAGENZ 99
5.2.3.2 TRANSAKTIVIERUNG VON PLHV-1-PROMOTOREN DURCH PLHV-1 ORF50,
ORFA6/BZLF1 H UND ORF57 100
5.2.3.2.1 TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET VON PLHV-1 ORF50 100
5.2.3.2.2 TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET VON PLHV-1 ORFA6/BZLF1 H 102
5.2.3.2.3 TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET VON PLHV-1 ORF57 105
5.2.4 TRANSAKTIVIERUNG VON PLHV-1-PROMOTOREN BEI KOEXPRESSION VON PLHV-1
ORF50 UND ORFA6/BZLF1 H 106
5.2.4.1 INDUKTION DER PLHV-1-PROMOTORAKTIVITAET DURCH ORF50 UND
ORFA6/BZLF1*
IN 293-GRAHAM-ZELLEN 106
5.2.4.2 INDUKTION DER PLHV-1-PROMOTORAKTIVITAET DURCH ORF50 UND
ORFA6/BZLF1 H
IN PK15-ZELLEN 108
5.2.5 TRANSAKTIVIERVNG VON PLHV-1-PROMOTOREN BEI KOEXPRESSION VON PLHV-1
ORF50 UND ORF57 111
5.Z5.1 INDUKTION DER PLHV-1-PROMOTORAKTIVITAET DURCH ORF50 UND ORF57 IN
293-GRAHAM-ZELLEN 111
5.2.5.2 INDUKTION DER PLHV-1-PROMOTORAKTIVITAET DURCH ORF50 UND ORF57IN
PK15-ZELLEN 113
5.2.6 INTERAKTIONSSTUDIEN ZWISCHEN DEN PLHV-1-PROTEINEN 116
5.2.6.1 VERSUCHE ZUR INTERAKTION ZWISCHEN ORF50 UND ORFA6/BZLFI1, 116
5.2.6.2 VERSUCHE ZUR INTERAKTION ZWISCHEN ORF50 UND ORF57 118
5.2. 7 UNTERSUCHUNGEN ZUR MOLEKULAREN WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN HUMANEN
UNDPORZINEN ^HERPESVIREN 120
5.2.7.1 AKTIVIERUNG VON EBV-PROMOTOREN DURCH EBV BRLF1 UND BZLF1 121
5.2.7.2 AKTIVIERUNG VON PLHV-1-PROMOTOREN DURCH EBV BRLF1 UND BZLF1 -
122
5.2.7.3 AKTIVIERUNG VON EBV-PROMOTOREN DURCH PLHV-1 ORF50 UND
ORFA6/BZLF1 B 125
5.Z8 VERSUCHE ZUR REAKTIVIERUNG VON PLHV-3 UND EBV 127
5.2.8.1 OPTIMIERUNG DER ELEKTROPORATION VON B-ZELLEN 127
5.2.8.1.1 OPTIMIERUNG DER ELEKTROPORATION VON L23-ZELLEN - -128
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.8.1.2 OPTIMIERUNG DER ELEKTROPORATION VON B95-8-ZELLEN 131
5.2.8.2 VERSUCHE ZUR REAKTIVIERUNG VON EBV 134
5.2.8.3 VERSUCHE ZUR REAKTIVIERUNG VON PLHV-3 137
5.2.8.4 VERSUCHE ZUR VIRUSREAKTIVIERUNG MITTELS KOKULTIVIERUNG 140
6. DISKUSSION 142
6.1 AUSWAHL DER REGULATORPROTEINE UND PROMOTOREN 142
6.2 PRUEFUNG DER FUNKTIONALITAET DER AUSGEWAEHLTEN PLHV-1-REGULATOREN 143
6.3 TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET VON PLHV-1 ORF50, ORFA6/BZLF1 H UND
ORF57 145
6.4 PLHV-1 PROMOTORAKTIVITAET BEI KOEXPRESSION VON ORF50 UND
ORFA6/BZLF1 H 148
6.5 PLHV-1 PROMOTORAKTIVITAET BEI KOEXPRESSION VON ORF50 UND ORF57.150
6.6 INTERAKTION ZWISCHEN PLHV-1 ORF50 UND ORFA6/BZLF1 H 152
6.7 INTERAKTION ZWISCHEN PLHV-1 ORF50 UND ORF57 153
6.8 INDUKTION DER EBV-PROMOTORAKTIVITAET IM HOMOLOGEN SYSTEM 154
6.9 INDUKTION DER EBV-PROMOTORAKTIVITAET DURCH PLHV-1-PROTEINE 155
6.10 INDUKTION DER EBV-PROMOTORAKTIVITAET DURCH EBV-PROTEINE 155
6.11 REAKTIVIERUNG VON HERPESVIREN 156
6.11.1 REAKTIVIERUNG DES LYTISCHEN INFEKTIONSZYKLUS VON EBV 157
6.11.2 REAKTIVIERUNG DES LYTISCHEN INFEKTIONSZYKLUS VON PLHV-3 161
6.11.3 VINJSREAKTIVIERUNG MITTELS KOKULTIVIERUNG 162
6.12 AUSBLICK 163
7. ZUSAMMENFASSUNG 165
8. SUMMARY * 167
9. ANHANG 169
9.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 169
9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 173
9.3 TABELLENVERZEICHNIS 175
10.LITERATURVERZEICHNIS 177
DANKSAGUNG 195
LEBENSLAUF 196
SELBSTAENDIGKEITSERKLAERUNG 197 |
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