Charakterisierung des Core-Proteins von Pestiviren:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen
VVB Laufersweiler
2007
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| Schriftenreihe: | Edition Scientifique
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Pestiviren 1
1.1.1 Eigenschaften und Funktion der Strukturproteine von Pestiviren 4
1.1.1.1 Glykoproteine ETm, El und E2 4
1.1.1.2 Kapsid-Protein (Core) 5
1.2 Eigenschaften und Funktion des Core-Proteins anderer
Mitglieder der Familie Flaviviridae 6
1.2.1 Hepatitis C Virus 6
1.2.2 Flaviviren 8
1.3 Zielsetzung der Arbeit 10
2 Material und Methoden 11
2.1 Material 11
2.1.1 Eukaryotische Zelllinien 11
2.1.2 Prokaryotische Zellen 11
2.1.3 Virusstämme H
2.1.4 Antikörper 12
2.1.5 Enzyme 13
2.1.6 Chemikalien 13
2.1.7 Verbrauchsmaterialien 14
2.1.8 Gerate 14
2.2 Methoden 15
2.2.1 Zellkulturtechniken für Säugerzellen und Virusarbeiten 15
2.2.1.1 Medien und Puffer 15
2.2.1.2 Allgemeine Zellkulturarbeiten 16
2.2.1.3 Elektroporation von RNS in SK6-Zellen 17
2.2.1.4 Indirekter immunhistochemischer Nachweis 18
2.2.1.4.1 Indirekte Immunperoxidase 8
2.2.1.4.2 Protein Nachweis durch indirekte Immunfluoreszenz 18
2.2.1.4.2.1 Einbettungsmedium 20
2.2.1.4.2.2 Färbung von Zellkernen mit
4 -6-Diamidino-2-phenylindole (DAP1) 20
. Inhaltsverzeichnis
2.2.1.5 Titration von Pestiviren 20
2.2.1.6 Bestimmung der Proteinkonzentration (BC-Mikroassay) 20
2.2.2 Herstellung monoklonaler Antikörper 21
2.2.2.1 Erzeugung rekombinanter Proteine 21
2.2.2.2 Immunisierung von Mäusen 22
2.2.2.3 Gewinnung und Ausplattierung von „Feeder -Zellen 23
2.2.2.4 Gewinnung der Splenozyten (Milzzellen) 23
2.2.2.5 Bestimmimg der Zellzahl 24
2.2.2.6 Fusion von Splenozyten und Myelomzellen 24
2.2.2.7 Selektion von Hybridomzellen 25
2.2.2.8 EL1SA zum Screening von Hybridom Überständen 25
2.2.2.9 Screening von Hybridomzellen 27
2.2.2.10 Klonierung positiver Hybridome 27
2.2.2.11 Produktion von mAks 27
2.2.2.12 lsotypisierung der mAks mit einem
kommerziellen vorgefertigten Test (ImmunoPure* Monoclonal
Antibody Isotyping Kit I (HRP/ABTS)) 28
2.2.2.13 Bestimmung der Epitope der anti Core-Protein mAks 28
2.2.3 Kolokalisierungsstudien 28
2.2.3.1 Kolokalisierung von Struktur- bzw. Nichtstrukturproteinen
mit dem ER 28
2.2.3.2 Kolokalisierung des Core-Proteins mit den Mitochondrien 29
2.2.3.2.1 Färbung von Mitochondrien 30
2.2.3.3 Kolokalisierung des Core-Proteins mit „lipiddroplets 30
2.2.3.3.1 Färbung der „ lipid droplets mit Red OH O 30
2.2.3.4 Kolokalisierung des Core-Proteins mit „P-Bodies 31
2.2.3.5 Kolokalisierung des Core-Proteins mit NS3 31
2.2.3.5.1 Direkte Markierung der mAks mit dem ,,Zenon*
Mouse Labeling Kit (Fa. Pierce) 32
2.2.3.5.1.1 Reinigung von monoklonalen A ntikörpern 3 2
2.2.3.6 Kolokalisierung des Core-Proteins mit NS5B 33
2.2.4 Protein-RNS Agarose Gel Bindungsassay 33
2.2.5 Proteinbiochemische Methoden 34
2.2.5.1 SDS-PAGE 34
Inhaltsverzeichnis
2.2.5.2 Coomassie-Färbung 35
2.2.5.3 Immunoblot-Analyse von Proteinen (Western Blot) 36
2.2.5.4 Gewinnung von Virionen aus dem Überstand
infizierter Zellkulturen 37
2.2.5.5 Präparation von Lysaten aus KSPVinjizierten
Zellen zur Western Blot Analyse 37
2.2.5.6 Präparation von Lysaten aus mit nzp7 NS5A-B
transfizierten Zellen zur Western Blot Analyse 37
2.2.6 Molekularbiologische Methoden 38
2.2.6.1 Anzucht von Bakterien 38
2.2.6.2 Plasmidisolierung 38
2.2.6.3 Herstellung und Transformation kompetenter Bakterien 40
2.2.6.4 Isolierung von Gesamt-RNS durch RNeasy 41
2.2.6.5 Phenol/Chloroform Extraktion von DNS 41
2.2.6.6 Ethanolpräzipitation von DNS/RNS und
Isopropanolpräzipitation von DNS 42
2.2.6.7 Quantifizierung von DNS/RNS-Proben 42
2.2.6.8 DNS- bzw. RNS-Agarose-Gelelektrophorese 43
2.2.6.9 Dephosphorylierung von DNS 44
2.2.6.10 Aufreinigung undLigation von DNS-Fragmenten 44
2.2.6.11 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 45
2.2.6.12 Ortsgerichtete Mutagenese mittels „ QuickChange™
Site-Directed Mutagenesis und Deletions-PCR 46
2.2.6.13 In vitro Transkription 48
2.2.6.13.1 Herstellung von Transkripten verschiedener Länge 49
2.2.6.14 Sequenzierung der DNS durch „Cycle-Sequencing mit
Fluoreszenzfarbstoff-markiertem Primer 49
2.2.6.15 Elektrophorese in denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgelen 50
2.2.7 Klonierungen 52
2.2.7.1 Synthetische Oligonukleotide 52
2.2.7.2 Klonierung des Gens des KSPV Core-Proteins 53
2.2.7.2.1 Generierung der am 3 -Ende verkürzten Formen des
KSPVCore-Protein Gens (pCore 6, pCore 8, pCore 11, pCore 14) 53
Inhaltsverzeichnis
2.2.7.3 Generierung eines KSPV Gesamtklons mit
einem Cystein an der Aminosäureposition 200 des Core-Proteins (pCore29) 54
2.2.7.4 Klonierung des Gens vom BVDVCore-Protein (p940) 54
2.2.7.4.1 Generierung der am 3 -Ende verkürzten Formen des BVDV
Core-Protein Gens (pCore 24, pCore 26, pCore 27, pCore 28) 55
2.2.7.5 Klonierung des KSPVNS5B-Protein Gens (pll41) 55
3 Ergebnisse
3.1 Klonierung, Expression und Aufreinigung des Core-Proteins vom Virus der klassischen
Schweinepest 56
3.1.1 Klonierung 56
3.1.2 Expression 58
3.1.3 Reinigung 60
3.2 Klonierung, Expression und A ufreinigung des B VD Vncp 7 Core-Proteins 61
3.2.1 Klonierung 61
3.2.2 Expression 61
3.2.3 Reinigung 62
3.3 Präparation monoklonaler A ntikörper gegen das pestivirale Core-Protein 63
3.3.1 Immunisierung 63
3.3.2 Fusion von Splenozyten immunisierter Mäuse mit Myelomzellen 64
3.3.2.1 Gewinnung von Splenozyten (Milzzellen) zur Fusion 65
3.3.2.2 Fusion von Splenozyten und Myelomzellen 65
3.3.3 Etablierung eines Screeningsystems zur Identifizierung
positiver Hybridome 65
3.3.4 ,£creening von Hybridom-Überständen im ELISA,
Selektion und Klonierung positiver Hybridome 66
3.3.4.1 „Screening der Fusionen von Splenozyten aus Mäusen,
die mit KSPV Core-Protein immunisiert wurden 67
3.3.4.2 „Screening der Fusionen von Splenozyten aus Mäusen,
die mit B VD V Core-Protein immunisiert wurden 67
3.3.5 Isotypisierung der gewonnenen monoklonalen Antikörper 67
_____ Inhaltsverzeichnis
3.4 Charakterisierung der anti Core-Protein mAks 68
3.4.1 Reaktion der mAks im Western Blot mit gereinigtem
bakteriellen Core-Protein öS
3.4.2 Nachweis des Core-Proteins in Virionen von Pestiviren verschiedener Spezies
im Western Blot mit den hergestellten monoklonalen Antikörpern 69
3.4.3 Epitop Lokalisierung der anti Core-Protein mAks 72
3.4.3.1 Epitop Lokalisierung von mAk GRS-Cl und GRS-C2 72
3.4.3..2 Epitop Lokalisierung der mAks GRS-C3, GRS-C4, GRS-C5, GRS-C6, GRS-C7
und GRS-C8 73
3.5 Charakterisierung des höheren Molekulargewichtproduktes des Core-Proteins vom
Stamm S90 und vom Isolat Gi-4 74
3.5.1 Stabilität des Produktes in Anwesenheit reduzierender Reagenzien 75
3.5.2 Funktion der Homodimerisierung von Core 76
3.6 RNS bindende Aktivität des KSPV Alfortm Core-Proteins 77
3.6.1 Bindung des Core-Proteins anpestivirale RNS 78
3.6.2 Bindung des Core-Proteins an KSPV RNS Transkripte
verschiedener Länge 79
3.6.3 Bindung des Core-Proteins an nicht pestivirale RNS 81
3.6.3.1 Bindung des Core-Proteins an RNS Homopolymere 82
3.6.4 Bindung des Core-Proteins an dsRNS 83
3.7 Nachweis des Core-Proteins von Pestiviren mit indirekter Immunfluoreszenz 83
3.8 Kolokalisierungsstudien des Core-Proteins in infizierten Zellen mit Hilfe der
konfokalen Lasermikroskopie 86
3.8.1 Kolokalisierung vom KSPV Core-Protein mit dem ER Marker
Protein-Disulfidisomerase (PDI) 86
3.8.1.1 Kolokalisierung der KSPV Strukturglykoproteine
ET , El und E2 mit PDI 89
3.8.2 Kolokalisierung vom KSPV Core-Protein mit Mitochondrien 92
3.8.3 Kolokalisierung des Core-Proteins mit ,JtNA processing
bodies (P-Bodies) 93
3.8.4 Kolokalisierung des KSPV Core-Proteins mit „lipiddroplets (LD) 94
3.8.5 Kolokalisierung des Core-Proteins mit den Bestandteilen des Replikationskomplexes
NS3undNS5B 95
3.8.5.1 Kolokalisierung des Core-Proteins mit NS3 96
. Inhaltsverzeichnis
3.8.5.2 Herstellung von mAk gegen das NS5B Protein von KSPV 97
3.8.5.2.1 K/onierung, Expression und Reinigung des KSPV Alfortm NS5B Proteins (RNS
abhängige RNS Polymerase) 97
3.8.5.2.2 Immunisierung von Mäusen und Fusion von Lymphozyten
mit MyelomzeUen 97
3.8.5.2.3 „Screening , Isolierung undKlonierungpositiver Hybridome 98
3.8.5.2.5 Charakterisierung der gegen das NS5B hergestellten monoklonalen Antikörper
GRS-Pol-1, -2, -3, -4, -5 und-6 98
3.8.5.2.5.1 Bestimmung des Subtyps der anti NS5B mAks 98
3.8.5.2.5.2 Western Blot Analyse der Hybridom-Überstände mit Zelllysaten von KSPV
infizierten und B VD V NS5A -B transient exprimierenden Zellen 98
3.8.5.2.5.3 Detektion des NS5B Proteins KSPV infizierter Zellen in indirekter
Immunfluoreszenz 100
3.8.5.3 Kolokalisierung des NS5B Proteins mit dem ER 101
3.8.5.4 Kolokalisierung des Core-Proteins mit NS5B 103
4 Diskussion 104
4.1 Herstellung und Charakterisierung von mAk gegen das pestivirale Core-Protein
und Nachweis des Core-Proteins in Virionen von Pestiviren verschiedener Spezies 104
4.2 Nachweis des Core-Proteins von Pestiviren verschiedener Spezies in infizierten
Zellen, und Kolokalisierungsuntersuchungen mit Hilfe monoklonaler Antikörper 106
4.3 Charakterisierung der RNS bindenden Aktivität des Core Proteins 109
5 Zusammenfassung 113
6 Summary 114
7 Literatur 115
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