Darstellung und Charakterisierung avianer wie chimärer Immunglobuline unter besonderer Berücksichtigung des humanen Bone Sialoproteins als Zielstruktur:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Marburg
Görich und Weiershäuser
2006
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| Schriftenreihe: | Wissenschaft in Dissertationen
827 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1.1 AVIANE ANTIKOERPER
1.1.1 STRUKTUR
1.1.2 BIOCHEMISCHE EIGENSCHAFTEN
1.1.3 VORTEILE IN THERAPIE UND DIAGNOSTIK
1.1.4 ANTIKOERPERDIVERSITAET
1.2 ANTIKOERPERBIBLIOTHEKEN
1.3 S I B L I N G - P R O T E I NE UND BSP
1.3.1 STRUKTUR DES BSP
1.3.2 EXPRESSION UND FUNKTION DES BSP
1.3.3 DIE ROLLE DES BSP BEI DER KNOCHENMETASTASIENING
1.4 ZIELSETZUNG
2 MATERIAL
2.1 ENZYME
2.2 ANTIKOERPER
23 CHEMIKALIEN UND BIOREAGENZIF.N
2.4 AFFINITAETSMATRIZES
2.5 BAKTERIENSTAEMME
2.6 ZELLLINIEN UND ZELLKULTUR
2.7 VEKTOREN
2.8 OLIGONUKLEOTIDE
2.9 PEPTTOE
2.10 PUFFER UND LOESUNGEN
2.11 MEDIEN
2.12 GROESSENSTANDARDS
2 . 13 SCFV-BIBLIOTHEK UND HEL.FF.RPHACEN
2.14 VERWENDETE KITS
2.15 VERBRAUCHSMATERIALIEN
2.16 GERAETE
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3 METHODEN 31
3.1 CHEMISCHE METHODEN 31
3.1.1 KOPPLUNG VON PROTEINEN UND PEPTIDEN MITTELS SULFO-SMCC 31
3.1.2 KOPPLUNG VON PROTEINEN UND PEPTIDEN MITTELS GLUTARDIALDEHYD 31
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 32
3.2.1 RNA-ISOLIERUNG AUS GEWEBE 32
3.2.2 CDNA-SYNTHESE 33
3.2.3 PCR 34
3.2.4 SUBKLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 36
3.2.5 SEQUENZIERUNG 36
3.2.6 ORTSGERICHTETE MUTAGENESE 37
3.2.7 GENERIERUNG EINER IMMUNEN AVIANEN SCFV-BIBLIOLHEK 38
3.3 PHAGE DISPLAY-TECHNOLOGIE 41
3.3.1 DARSTELLUNG VON M13KO7-HELFERPHAGEN 41
3.3.2 TITERBESTIMMUNG VON M13-PHAGEN 41
3.3.3 DARSTELLUNG REKOMBINANTER PHAGEN 42
3.3.4 WACHSTUM UND REPLIKATION VON SCFV-BIBLIOTHEKEN 42
3.3.5 FESTPHASENSELEKTION 43
3.3.6 REINFEKTION 44
3.3.7 AMPLIFIKATION SELEKTIERTER PHAGEN 45
3.3.8 TITERBESTIMMUNG DES SELEKTIONSELUATES 45
3.3.9 POLYKLONALERELISA 45
3.3.10 MONOKLONALERELISA 46
3.3.11 INFEKTION VON NON-SUPRESSORSTAEMMEN 47
3.4 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 47
3.4.1 KULTIVIEREN UND PASSAGIEREN VON HEK293- UND LMH-ZELLEN 47
3.4.2 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 48
3.4.3 KRYOKONSERVIERUNG UND REVITALISIERUNG VON ZELLEN 48
3.5 EXPRESSION IN PRO- UND EUKARYONTISCHEN SYSTEMEM 49
3.5.1 EXPRESSION VON MBP-BSP-FUSIONSPROTEINEN IN E. COLI 49
3.5.2 PERIPLASMATISCHE EXPRESSION VON LOESLICHEN SCFV IN E. COLI 50
3.5.3 EXPRESSION VON IGY-KONSTRUKTEN IN HEK293-UND LMH-ZELLEN 51
3.6 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 52
3.6.1 EXTRAKTION VON BSP AUS HUMANEN KNOCHEN 52
IMAGE 3
3.6.2 EXTRAKTION VON IGY AUS HUEHNEREIERN 52
3.6.3 ANALYSE DER GLYKOSTRUKTUREN VON IGY 53
3.6.4 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE VERFAHREN 55
3.6.4.1 IMAC 55
3.6.4.2 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE MITTELS LYSOZYM-SEPHAROSE 55
3.6.4.3 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE MITTELS AMYLOSE-MATRIX 56
3.6.4.4 THIOPHILE INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE 56
3.6.4.5 AFFINITAETSREINIGUNG VON ANTI-BSP25-IGY 57
3.7 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 58
3.7.1 EL1SA 58
3.7.2 NACHWEIS VON PROTEINEN AUF NITROCELLULOSEMEMBRANEN (IMIMMPRINTING)
58
3.7.3 DOT BLOT-ANALYSE 59
3.7.4 VIRUS-NEUTRALISATIONSANALYSE 60
I ERGEBNISSE 61
4.1 KLONIERUNG UND EXPRESSION AVIANER ANTIKOERPER-FORMATE 61
4.1.1 AMPLIFIKATION DER KONSTANTEN IMMUNGLOBULINKETTEN 62
4.1.2 KLONIERUNG CHIMAERER IGY-KONSTRUKTE 63
4.1.3 EXPRESSION DER CHIMAEREN IGY-KONSTRUKTE IN HEK293-ZELLEN 66
4.1.4 KLONIERUNG UND EXPRESSION AVIANER IGY-KONSTRUKTE 69
4.1.5 ANALYSE DER REKOMBINANTEN IGY 73
4.1.6 KLONIERUNG UND EXPRESSION EINES CHIMAEREN IGEY-KONSTRUKTES 78
4.1.7 KLONIERUNG UND EXPRESSION VON VERKUERZTEN IGY-KONSTRUKTEN 81
4.1.8 EXPRESSION VON IGY-KONSTRUKTEN IN LMH-ZELLEN 85
4.1.9 KLONIERUNG UND EXPRESSION VON DEGLYKOSYLIERTEN IGY-KONSLRUKLEN 87
4.1.10 GENERIERUNG MONOKLONALER ANTI-IGY-ANTIKOERPER 89
4.2 DARSTELLUNG REKOMBINANTER ANTI-BSP-ANTIKOERPF.R 93
4.2.1 VORARBEITEN 94
4.2.1.1 REINIGUNG VON POLYKLONALEN BSP-SPEZIFISCHEN IGY 94
4.2.1.2 GENERIERUNG VON BSP-PEPTID-KONJUGATEN 95
4.2.1.3 AFFINITAETSREINIGUNG BSP-SPEZIFISCHER IGY 97
4.2.1.4 EXPRESSION VON MBP-BSP-FUSIONSPROTEINEN 99
4.2.1.5 REINIGUNG VON BSP AUS HUMANEN KNOCHEN 103
4.2.2 SELEKTION HUMANER BSP-SPEZIFISCHER SCFV 105
4.2.2.1 CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN SCFV 108
IMAGE 4
4.2.2.2 KLONIERUNG UND EXPRESSION CHIMAERER BSP-SPEZIFISCHER ANTIKOERPER
110
4.2.3 GENERIERUNG EINER BSP-SPEZIFISCHEN IMMUNBIBLIOTHEK 115
4.2.3, L AMPLIFIKATION DER AVIANEN VARIABLEN REGIONEN 116
4.2.3.2 HYBRIDISIERUNG DER VARIABLEN REGIONEN ZU VOLLSTAENDIGEN SCFV 117
4.2.3.3 ERSTELLUNG DER AVIANEN SCFV-BIBLIOTHEK 118
5 DISKUSSION 123
5.1 REKOMBINANTE EXPRESSION AVIANER ANTIKOERPER 123
5.1.1 EIGENSCHAFTEN DER REKOMBINANTEN IGY 127
5.1.2 EXPRESSION MINIATURISIERTER IGY-FORMATE 129
5.1.3 DEGLYKOSYLIERTE IGY-KONSTRUKTE 131
5.1.4 SELEKTION IGY-SPEZIFISCHER SCFV 133
5.2 SELEKTION REKOMBINANTER BSP-SPEZIFISCHER ANTIKOERPER 134
5.2.1 BSP ALS ZIELSTRUKTUR FUER DIE SELEKTION 134
5.2.2 SELEKTION HUMANER SCFV MIT SPEZIFITAET FUER BSP 139
5.2.3 ETABLIERUNG DER GENERIERUNG EINER IMMUNEN SCFV-BIBLIOTHEK 140
5.2.4 AUSBLICK 143
6 ZUSAMMENFASSUNG 145
7 ABSTRACT 147
8 LITERATUR 149
9 ANHANG 169
9.1 OLIGONUKLEOTIDE 169
92 SEQUENZDATEN 171
9.3 SEQUENZDATEN DER SELEKTIERTEN SCFV 176
9.4 GEFAHRSTOFFE UND SICHERHEITSDATEN 180
9.5 VEKTOREN 182
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