Untersuchungen zu möglichen Bindungs- und Aktivierungsfaktoren der zellulären Immunantwort bei Manduca sexta L.:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
---|---|
Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
2005
|
Schlagworte: | |
Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
DIE
ZELLULAERE
IMMUNANTWORT
.
1
1.2
DIE
HUMORALE
IMMUNANTWORT
.
3
1.2.1
DIE
IMMUNPROTEINE
.
3
1.2.2
GENREGULATION
DER
EXPRESSION
ANTIMIKROBIELLER
PROTEINE
UND
PEPTIDE
UEBER
TOLL
UND
IMD-WEG
.
5
1.2.3
MELANISIERUNG
UND
PROPHENOLOXIDASEKASKADE
.
8
1.2.4
WEITERE
FAKTOREN
DER
HUMORALEN
IMMUNANTWORT
.
9
1.3
WELCHE
KOMPONENTEN
UND
PROZESSE
SPIELEN
BEI
DER
AUSLOESUNG
ZELLULAERER
BZW.
HUMORALER
IMMUNREAKTIONEN
EINE
ROLLE?
.
10
1.3.1
OBERFLAECHENKOMPONENTEN
VON
BAKTERIEN
UND
PILZEN,
DIE
ALS
PAMPS
DIENEN
KOENNEN
.
10
1.3.2
PATTEM
RECOGNITION
PROTEINS
BEI
INSEKTEN
.
12
1.4
ANNEXINE
.
16
1.4.1
NOMENKLATUR
UND
MINIMALE
CHARAKTERISTIKA
DER
ANNEXINE
.
16
1.4.2
STRUKTUR
DER
ANNEXINE
.
18
1.4.3
VORKOMMEN
VON
ANNEXINEN
BEI
INSEKTEN
.
20
1.4.4
EIGENSCHAFTEN
VON
ANNEXINEN
.
20
1.5
ALTERNATIVES
EXON-SPLEISSEN
.
22
1.6
ZIELSETZUNG
DER PROMOTIONSARBEIT,
.
24
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
25
2.1
MATERIAL
.
25
2.1.1
GERAETE
.25
2.1.2
CHEMIKALIEN
UND
ALLGEMEINE
VERFAHREN
.
27
2.1.3
DER
VERSUCHSORGANISMUS
MANDUCA
SEXTA
28
2.1.4
BAKTERIENSTAEMME
29
2.1.5
ANTIKOERPER
30
2.1.6
HAEUFIG
VERWENDETE
LOESUNGEN
.
31
2.2
METHODEN
.
33
2.2.1
ZUCHT
VON
M.
SEXTA
33
2.2.2 KULTIVIERUNG
VON
BAKTERIEN
35
2.2.3 HYBRIDOMAZELLKULTUR-ARBEITEN
37
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.4
GEWINNUNG
VON
HAEMOZYTEN
UND
PLASMA
AUS
DER
HAEMOLYMPHE
VON
M.
SEXTA
.
40
2.2.5
HERSTELLUNG
VON
HAEMOZYTEN
UND
FETTKOERPERLYSAT
FUER
DIE
GELELEKTRO
PHORESE
.
42
2.2.6
INJEKTIONSVERSUCHE
.
42
2.2.6.1
HERSTELLUNG
DER
INJEKTIONSSUSPENSIONEN
.
43
2.2.6.1.1
HERSTELLUNG
VON
BAKTERIENSUSPENSIONEN
ZUR
INJEKTION
43
2.2.6.1.2
HERSTELLUNG
VON
SUSPENSIONEN
VERSCHIEDENER
ZELLWAND
BESTANDTEILE
GRAM-POSITIVER
BAKTERIEN
ZUR
INJEKTION
.
45
2.2.6.1.3
FITC-MARKIERUNG
VON
BAKTERIEN
FUER
INJEKTIONSVERSUCHE
47
2.2.6.2
INJEKTION
VERSCHIEDENER
PROVOKATOREN
IN
M.
SEXTA
.
48
2.2.7
BESTIMMUNG
VON
ANTIBAKTERIELLER
BZW.
LYTISCHER
AKTIVITAET
(HEMMHOFTESTS)
.
48
2.2.8
IMMUNHISTOCHEMIE
.
50
2.2.8.1
HERSTELLUNG
VON
HAEMOZYTEN-MONOLAYERN
.
50
2.2.8.2
PRAEPARATION
VON
GEWEBEN
UND
ORGANEN
(WHOLE-MOUNT-PRAEPARAETE)
.
51
2.2.8.3
ANFERTIGUNG
VON
GANZTIERSCHNITTEN
(HISTOLOGIE)
.
52
2.2.9
VERSUCHE
ZUR
PHAGOZYTOSE
VON
BAKTERIEN
.
53
2.2.9.1
PHAGOZYTOSE-ASSAY
MIT
HAEMOZYTEN
VON
M.
SEXTA
.
53
2.2.9.2
PHAGOZYTOSE-VERSUCHE
IN
VIVO
.
54
2.2.9.3
QUENCHING
.
55
2.2.10
UNTERSUCHUNG
VON
HAEMOZYTEN
MITTELS
TRANSMISSIONSELEKTRONEN
MIKROSKOPIE
(TEM)
.
56
2.2.11
AFFINITAETSPRAEZIPITATION
(BAKTERIENBINDUNGS-ASSAY)
.
57
2.2.11.1
PRINZIPIELLES
VERFAHREN
DER
AFFINITAETSPRAEZIPITATION
.
58
2.2.11.2
/N-V/TRO-VERSUCHE
ZUR
LYSE
VON
M.
LUTEUS
.
60
2.2.11.3
HEMMUNG
DES
LYSOZYMVERDAUS
MIT
IMIDAZOL
BZW.
HISTAMINDIHYDROCHLORID
.
61
2.2.12
POLYACRYLAMIDGEL
ELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
62
2.2.13
WESTERN-BLOTTING-VERFAHREN
.
65
2.2.14
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
.
67
2.2.15
SCREENING
VON
CDNA-EXPRESSIONSBANKEN
MIT
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
68
2.2.15.1
TITRATION
DER
CDNA-BANKEN
.
68
2.2.15.2
ERSTES
SCREENING
DER
CDNA-BANKEN
MIT
EINEM
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
.
70
2.2.15.3
ZWEITES
UND
WEITERE
SCREENINGS
DER
POTENTIELL
POSITIVEN
KLONE
.
71
2.2.15.4
/N-V/VO-EXZISION
(EINZELKLON-EXZISION)
DER
PHAGEMIDE
.
72
2.2.16
BESTIMMUNG
DER
INSERTGROESSE
AUSGEWAEHLTER
KLONE
.
73
2.2.16.1
PRAEPARATION
DER
PLASMID-DNA
.
74
2.2.16.2
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
PLASMID-DNA
.
74
2.2.16.3
PCR
ZUR
BESTIMMUNG
DER
INSERTGROESSE
AUSGEWAEHLTER
KLONE
.
74
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.2.16.4
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
.
75
2.2.17
ERSTELLEN
EINER
EST-BANK
77
2.2.18
DNA-SEQUENZIERUNG
78
2.2.19
AUSWERTUNG
DER
ERGEBNISSE
DER
SEQUENZIERUNG
MIT
BIOINFORMATISCHEN
METHODEN
(SEQUENZVERGLEICHE)
78
2.2.20
UNTERSUCHUNG
DES
ANNEXIN
IX-GENS
VON
M.
SEXTA
79
2.2.20.1
GEWINNUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
HAEMOZYTEN
ALS
MATRIZE
FUER
DIE
PCR
80
2.2.20.2
PRIMER
DESIGN
UND
SYNTHESE
81
2.2.20.3
DURCHFUEHRUNG
DER
PCR
81
3
ERGEBNISSE
.
83
3.1
ANALYSEN
DER
PROVOKATORKOMPETENZ
VERSCHIEDENER
BAKTERIEN
BZW.
ISOLIERTER
BAKTERIELLER
KOMPONENTEN
ZUR
AUSLOESUNG
EINER
IMMUNANTWORT
BEI
M.
SEXTA
.
83
3.1.1
AUSWERTUNG
DER
HEMMHOFTESTS
ZUR
BESTIMMUNG
DER
BAKTERIOLYTISCHEN
AKTIVITAET
GEGEN
M.
LUTEUS
83
3.1.2
VERGLEICH
DER
PROTEINMUSTER
ZELLFREIER
HAEMOLYMPHE
VON
UNBEHANDELTEN
UND
BAKTERIEN-INFIZIERTEN
M.
SEXTA-LARVEN
(SDS-PAGE)
87
3.1.3
NACHWEIS
VON
HAEMOLIN
UND
LYSOZYM
IN
DER
HAEMOLYMPHE
VON
M.
SEXTA-LARVEN
MIT
DEM
WESTERN-BLOTTING-VERFAHREN
89
3.1.4
NACHWEIS
VON
ATTACIN,
HAEMOLIN
UND
LYSOZYM
IN
DEN
HAEMOZYTEN
VON
M.
SEXTA-LARVEN
(MONOLAYER)
90
3.2
UNTERSUCHUNGEN
UEBER
DEN
VERBLEIB
INJIZIERTER
BAKTERIEN
UND
DEN
VERLAUF
DER
ZELLULAEREN
ABWEHR
.
91
3.2.1
BEOBACHTUNGEN
AN
HAEMOZYTEN
UND
FETTKOERPERN
VON
M.
SEXTA-LARVEN
NACH
INJEKTION
VERSCHIEDENER
BAKTERIEN
92
3.2.2
NACHWEIS
DER
PHAGOZYTOSE
VON
B.
MEGATERIUM
DURCH
HAEMOZYTEN
VON
M.
SEXTA-LARVEN
.100
3.2.2.1
QUENCHING
MITTELS
TRYPANBLAU
RESP.
PROPIDIUMJODID
100
3.2.2.2
NACHWEIS
DER
PHAGOZYTOSE
VON
8.
MEGATERIUM
DURCH
HAEMOZYTEN
VON
M.
SEXTA
MITTELS
TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE
100
3.3
NACHWEIS
POTENZIELLER
BINDUNGSFAKTOREN
FUER
GRAM-POSITIVE
BAKTERIEN
IN
DER
HAEMOLYMPHE
VON
M.
SEXTA
.
108
3.3.1
PROBLEMATIK
VON
M.
LUTEUS
ALS
AFFINITAETSMATRIX
.
108
3.3.2
HEMMUNG
DES
LYSOZYM-VERDAUS
VON
M.
LUTEUS
DURCH
IMIDAZOL
BZW.
HISTAMIN
111
3.3.3
AFFINITAETSPRAEZIPITATION
MIT
M.
LUTEUS
ALS
MATRIX
UND
HISTAMIN
ALS
HEMMSTOFF
113
3.3.4
AFFINITAETSPRAEZIPITATION
MIT
B.
MEGATERIUM
ALS
MATRIX
113
3.4
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
FUER
EINE
ZELLULAERE
IMMUNABWEHR
MOEGLICHERWEISE
NOTWENDIGEN
HAEMOZYTENPROTEINE
MITTELS
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
115
3.4.1
AUSWAHL
GEEIGNETER
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
FUER
DAS
SCREENING
VON
CDNA-BANKEN
115
3.4.2
SCREENING
VON
HAEMOZYTEN
UND
FETTKOERPER-CDNA-BANK
MIT
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
116
3.4.3
DATENBANK-RECHERCHEN
.
124
3.4.4
VERGLEICHENDE
ANALYSEN
DER
SEQUENZEN
VERSCHIEDENER
ANNEXIN
IX-KLONE
VON
M.
SEXTA
.
127
3.4.5
CHARAKTERISIERUNG
DES
M.
SEXTA-ARMEXM
IX
.
129
3.4.5.1
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
UND
ERMITTLUNG
DES
ISOELEKTRISCHEN
PUNKTES
.
129
3.4.5.2
WESTERN
BLOT
MIT
HAEMOZYTEN
UND
FETTKOERPERLYSAT
129
3.4.5.3
EINGRENZUNG
DER
POTENTIELLEN
ANTIKOERPERBINDUNGSSTELLE
DURCH
SEQUENZVERGLEICHE
.
131
3.4.5.4
UEBERPRUEFUNG
DER
M.
SEXTA-ANNEXIN
IX-SEQUENZ
AUF
DAS
VORHANDEN
SEIN
EINES
SIGNALPEPTIDS
.
131
3.4.5.5
VORAUSSAGE
UEBER
DAS
VORHANDENSEIN
VON
A-HELICES
.
132
3.4.5.6
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
HYDROPHOBIZITAET
UND
ZUM
VORHANDENSEIN
VON
TRANSMEMBRANBEREICHEN
.
132
3.4.5.7
UNTERSUCHUNG
DER
PUTATIVEN
ISOFORM
A
DES
M.
SEXTA-ANNEXIN
IX
AUF
EXON-INTRON-SPLEISSSTELLEN
BZW.
SOLCHE
FUER
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
134
3.4.6
IMMUNHISTOLOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
ANNEXIN
IX
IN
VERSCHIEDENEN
GEWEBEN
VON
M.
SEXTA
.
137
3.4.6.1
NACHWEIS
VON
ANNEXIN
IX
IN
HAEMOZYTEN
137
3.4.6.1.1
VERGLEICH
VON
HAEMOZYTENMONOLAYEM
UNBEHANDELTER
M.
SEXTA
LARVEN
MIT
SOLCHEN,
DENEN
B.
MEGATERIUM
INJIZIERT
WORDEN
WAR
137
3.4.6.1.2
HAEMOZYTEN-MONOLAYER
NACH
PHAGOZYTOSE
VON
HEFE
(IN-VITRO-PHAGOZYTOSE-ASSAY)
.
140
3.4.6.2
NACHWEIS
VON
ANNEXIN
IX
IN
ANDEREN
GEWEBEN
.
140
3.
4.6.2.1
WHOLE
MOUNT
PRAEPARATIONEN
VON
FETTKOERPER,
INTEGUMENTINNENSEITE
UND
DARMEPITHEL
140
3.4.6.2.2
NACHWEIS
VON
ANNEXIN
IX
AUF
GANZTIERSCHNITTEN
.
142
3.5
AMPIFIZIERUNG
EINES
SEQUENZABSCHNITTS
IM
C-TERMINUS
DES
ANNEXIN
IX-
GENS
AUS
HAEMOZYTEN
VON
M.
SEXTA
.
142
3.6
ERGEBNISSE
DES
EST-PROJEKTS
.
143
4
DISKUSSION
.
144
4.1
PROVOKATORKOMPETENZ
VON
BAKTERIEN
UND
ISOLIERTEN
BAKTERIELLEN
KOMPONENTEN
ZUR
AUSLOESUNG
EINER
IMMUNANTWORT
BEI
M.
SEXTA
.
144
4.1.1
UEBERPRUEFUNG
DER
PROVOKATORKOMPETENZ
GRAM-POSITIVER
BAKTERIEN
BZW.
DEREN
OBERFLAECHENKOMPONENTEN
MIT
HEMMHOFTESTS
.
145
INHALTSVERZEICHNIS
V
4.1.2
GELELEKTROPHORETISCHEN
ANALYSEN
UND
WESTERN
BLOT
ZUR
UEBERPRUEFUNG
DER
PROVOKATORKOMPETENZ
149
4.1.3
NACHWEIS
VON
ANTIMIKROBIELLEN
PROTEINEN
BZW.
PEPTIDEN
IN
HAEMOZYTEN
VON
M.
SEXTA-LARVEN
152
4.2
PHAENOMENE
DER
ZELLULAEREN
ABWEHR
UND
IHR
ZEITLICHER
VERLAUF
NACH
INJEKTION
VON
GRAM-POSITIVEN
BAKTERIEN
IN
M.
SEXTA-LARVEN
.
152
4.2.1
VERBLEIB
VON
B.
MEGATERIUM
IM
HAEMOZOEL
VON
M.
SEXTA-LARVEN
NACH
DER
INJEKTION
153
4.2.2
VERBLEIB
VON
M.
LUTEUS
IM
HAEMOZOEL
VON
M.
SEXTA-LARVEN
NACH
DER
INJEKTION
155
4.2.3
NACHWEIS
DER
PHAGOZYTOSE
VON
B.
MEGATERIUM
DURCH
HAEMOZYTEN
VON
M.
SEXTA
156
4.3
POTENZIELLE
BINDUNGSFAKTOREN
FUER
GRAM-POSITIVE
BAKTERIEN
AUS
DER
HAEMOLYMPHE
VON
M.
SEXTA-LARVEN
.
158
4.4
AUSBLICK:
PGRPS
BEI
M.
SEXTA
.
161
4.5
SCREENING
DER
HAEMOZYTEN
UND
DER
FETTKOERPER-CDNA-BANK
VON
M.
SEXTA
MIT
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
-
METHODENKRITIK
.
162
4.6
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
M.
SEXTA-ANNEXIN
IX
.
,
163
4.6.1
BEURTEILUNG
DER
SEQUENZIERTEN
MS#78-POSITIVEN
KLONE
163
4.6.2
IDENTIFIZIERUNG
POTENZIELLEN
M.
SEXTA-ANNEXIN
IX-LSOFORMEN
.
165
4.6.2.1
KURZE
DARSTELLUNG
DES
B.
MORI-ANNEXIN
IX
165
4.6.2.2
VERGLEICH
DES
B.
MORI-ANNEXIN
IX
MIT
DEM
VON
M.
SEXTA
166
4.6.3
CHARAKTERISIERUNG
DES
M.
SEXTA-ANNEXIN
IX
167
4.6.3.1
ENTSTEHUNG
VON
DREI
ISOFORMEN
DES
M.
SEXTA-ANNEXIN
DURCH
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
168
4.6.3.2
UNTERSUCHUNG
DES
POTENZIELLEN
INTRONS
IN
KLON
MH6/1-8I1
.
170
4.6.3.3
MOLEKULARGEWICHT,
ISOELEKTRISCHER
PRUNKT
UND
HYDROPHOBIZITAET
DES
M.
SEXTA-ANNEXIN
IX
172
4.6.3.4
ANNEXIN-DOMAENEN
UND
BINDUNGSMOTIVE
174
4.6.4
NACHWEIS
VON
ANNEXIN
IX
BEI
M.
SEXTA
UND
ANDEREN
INSEKTEN
.
177
4.6.5
BETRACHTUNGEN
ZUR
POTENZIELLEN
FUNKTION
VON
ANNEXIN
.
180
4.6.6
AUSBLICK
DER
ANNEXIN-UNTERSUCHUNGEN
181
4.7
DISKUSSION
DER
ERGEBNISSE
DES
EST-PROJEKTS
.
181
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
188
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
190
VI
INHALTSVERZEICHNIS
7
ANHANG
A
.
A1
TAB.
A1
.
A1
TAB.
A2
.
A
1
TAB.
A3
.
A
2
TAB.
A4
.
A
3
ABB.
A1
.
A4
ABB.
A2
.
A
5
ABB.
A3
.
A
5
ABB.
A4
.
A
6
ABB.
A5
.
A
6
ABB.
A6
.A17
ABB.
A7
.A27
ABB.
A8
.
A47
ABB.
A9
.A49
ABB.
A10.
A51
ABB.
A11
A52
8
ANHANG
B
.
B1
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B1
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DANKSAGUNG
ERKLAERUNG |
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author | Lesch, Christine |
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