Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von redoxaktiven Proteinen des Malariaparasiten Plasmodium falciparum:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2005
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
VI
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
VIII
TABELLENVERZEICHNIS
.
X
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
PLASMODIUM
FALCIPARUM
(PF)
.
1
1.1.1
PLASMODIUM
FALCIPARUM
UND
MALARIA
.
1
1.1.2
BESONDERHEITEN
DES
ORGANISMUS
.
5
1.1.2.1
DER
APICOPLAST
.
5
1.1.2.2
HAEMOGLOBIN-ABBAU
.
9
1.2
ANTIOXIDATIVE
SYSTEME
.
11
1.2.1
DAS
GLUTATHION-SYSTEM
.
12
1.2.1.1
GLUTATHION
(GSH)
UND
GLUTATHIONREDUKTASE
(GR)
.
12
1.2.1.2
GLUTAREDOXIN
(GRX)
.
13
1.2.2
DAS
THIOREDOXIN-SYSTEM
.
15
1.2.2.1
THIOREDOXINREDUKTASE
(TRXR)
.
15
1.2.2.2
THIOREDOXIN
.
17
1.2.2.3
PEROXIREDOXINE
(PRX)
.
21
1.2.2.3.1
EINTEILUNG
.
22
1.2.2.3.2
MECHANISMUS
UND
KINETIK
.
23
1.2.2.3.3
STRUKTUR
UND
OLIGOMERISIERUNG.
25
1
.2.2.3.4
REDUZIERENDE
SUBSTRATE
.
27
1.2.2.3.5
OXIDIERENDE
SUBSTRATE
.
28
1.2.2.3.6
REGULATION
UND
PHYSIOLOGISCHE
FUNKTION
.
29
1
.2.2.3.7
SITUATION
IN
PLASMODIUM
FALCIPARUM
.
30
1.3
ZIELSETZUNG
.
31
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
32
2.1
MATERIAL
.
32
2.1.1
CHEMIKALIEN
.
32
2.1.2
GERAETE
.
33
2.1.3
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
33
2.1.4
MATERIAL
ZUR
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
34
2.1.5
GROESSENSTANDARDS
.
34
2.1.5.1
DNA-MARKER
.
34
2.1.5.2
PROTEIN-MARKER
.
34
2.1.6
MOLEKULARBIOLOGISCHE
REAGENZIENSAETZE
.
34
2.1.7
PROTEINBIOCHEMISCHE
REAGENZIENSAETZE.
34
2.1.8
MATERIAL
ZUR
KRISTALLISATION
.
35
2.1.9
PLASMIDE
.
35
2.1.10
ENZYME
.
35
2.1.11
BAKTERIENSTAEMME
.
36
2.1.12
LOESUNGEN
.
37
2.1.12.1
STAMMLOESUNGEN
.
37
INHALTSVERZEICHNIS
N
2.1.12.2
MEDIEN
.
37
2.1.12.3
PUFFER
.
37
2.1.12.3.1
PUFFER
ZUR
PLASMIDISOLIERUNG
.
37
2.1.12.3.2
PRAEPARATIONS
UND
SAEULENPUFFER
.
38
2.1.12.3.3
ASSAY-PUFFER
.
38
2.1.12.4
ELEKTROPHORESE
UND
BLOTTINGPUFFER
.
39
2.1.12.5
KRISTALLISATIONSPUFFER
.
41
2.2
METHODEN
.
42
2.2.1
MIKRO
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
42
2.2.1.1
PLASMIDPRAEPARATION
AUS
ESCHERICHIA
COLI
.
42
2.2.1.2
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
42
2.2.1.3
KLONIERUNG
.
44
2.2.1.3.1
RESTRIKTION
.
44
2.2.1.3.2
LIGATION
.
45
2.2.1.3.3
ZIELGERICHTETE
MUTAGENESE
(SITE-DIRECTED
MUTAGENESIS)
.
45
2.2.1.4 TRANSFORMATION
IN
ESCHERICHIA
COLI
.
46
2.2.1.4.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI-ZELLEN
(CALCIUMCHLORID-METHODE)
.
46
2.2.1.4.2
TRANSFORMATION
.
46
2.2.1.4.3
SELEKTION
/
IDENTIFIZIERUNG
POSITIVER
KLONE
.
46
2.2.1.4.4
HETEROLOGE
GENEXPRESSION
IN
E.
COLI
.
47
2.2.1.5
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IM
AGAROSEGEL
.
47
2.2.2
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
.
48
2.2.2.1
PROTEINREINIGUNG
.
48
2.2.2.1.1
GEWINNUNG
VON
PROTEINROHEXTRAKTEN
.
48
2.2.2.1.2
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
NI-NTA-AGAROSE
.
48
2.2.2.1.3
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
2
'
,5
'
-ADP-SEPHAROSE
.
48
2.2.2.1.4
KONTROLLE
MITTELS
SDS-PAGE
.
49
2.2.2.2
PROTEINANALYSE
.
.
51
2.2.2.2.
1
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
51
2.2.2.2.2
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
MITTELS
GELFILTRATION
.
51
2.2.2.2.3
IMMUNOLOGISCHER
PROTEINNACHWEIS
(WESTERN
BLOT)
.
53
2.2.2.3
ENZYMKINETIK
.
54
2.2.2.3.1
DTNB-BESTIMMUNG
.
54
2.2.2.3.2
INSULIN-ASSAY
.
54
2.2.2.3.3
TRXR-ASSAY
.
55
2.2.2.3.4
TRX-ENDPUNKTBESTIMMUNG
.
56
2.2.2.3.5
TPX-ASSAY
.
56
2.2.2.3.6
GR-ASSAY
.
56
2.2.2.3.7
HEDS-ASSAY
.
57
2.2.2.3.8
GRXPX-ASSAY
.
57
2.2.2.3.9
LIP-DH-ASSAY
.
57
2.2.2.3.10
BERECHNUNG
KINETISCHER
PARAMETER
.
57
2.2.2.4
KRISTALLISATION
.
59
2.2.2.4.
1
KRISTALLISATIONS-SCREENING
.
59
2.2.2.4.2
OPTIMIERUNG
DER
KRISTALLISATIONSBEDINGUNGEN
.
59
2.2.3
ANZUCHT
VON
PLASMODIUM
FALCIPARUM
.
60
2.2.3.1
KULTIVIERUNG
.
60
2.2.3.2
SYNCHRONISATION
DER
KULTUREN
.
60
3
ERGEBNISSE
.
61
3.1
THIOREDOXINE
UND
THIOREDOXIN-AEHNLICHE
PROTEINE
AUS
PF
.
61
INHALTSVERZEICHNIS
M
3.1.1
THIOREDOXIN-LIKEPROTEINX
(TLPL)
.
61
3.1.1.1
KLONIERUNG
.
61
3.1.1.2
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
.
62
3.1.1.3
BIOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNGEN
MIT
TLPL
.
62
3.1.2
THIOREDOXIN-LIKE
PROTEINL
(TLP2)
.
64
3.1.2.1
KLONIERUNGEN
.
64
3.1.2.2
UEBEREXPRESSION
.
65
3.1.2.3
IN
VZTRO-TRANSLATION
.
68
3.1.2.4
KLONIERUNG,
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
MBP-TLP2-FUSION
.
68
3.1.3
THIOREDOXIN
2
(TRX2)
.
71
3.1.3.1
KLONIERUNGEN
.
71
3.1.3.2
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
TRX2K;
BIOCHEMISCHE
INTERAKTIONEN
.
72
3.1.3.3
UEBEREXPRESSION
UND
VORLAEUFIGE
CHARAKTERISIERUNG
DES
TRX2SK
.
74
3.1.4
THIOREDOXIN
3
(TRX3)
.
75
3.1.4.1
KLONIERUNG,
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
.
75
3.1.4.2
VORLAEUFIGE
REDOX-ERGEBNISSE
.
77
3.2
HERSTELLUNG
DES
PFTRXL
OHNE
HIS-TAG
(TRXL-HIS)
.
78
3.2.1
HERSTELLUNG
EINES
PQE30PFTRXL-KONSTRUKTS
OHNE
HIS-TAG
.
78
3.2.2
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
TAG-FREIEN
PFTRXL
.
79
3.2.3
KRISTALLANSAETZE
.
80
3.3
HERSTELLUNG
VERSCHIEDENER
PFTRXR-FORMEN
.
81
3.3.1
N-TERMINAL
VERLAENGERTE,
YYALTERNATIVE
"
PFTRXR
.
81
3.3.1.1
KLONIERUNG,
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
.
81
3.3.1.2
HERSTELLUNG
EINER
ALTPFTRXR
OHNE
HIS-TAG
.
82
3.3.2
N-TERMINAL
VERKUERZTE
PFTRXR
.
83
3.3.2.1
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
.
83
3.3.3
PFTRXR
OHNE
HIS-TAG
.
84
3.3.3.1
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
.
84
3.3.3.2
KRISTALLISATION
DER
PFTRXR-HIS
.
85
3.3.4
INHIBITORMESSUNGEN
AN
PFTRXR
.
86
3.3.5
INHIBITORTESTS
AN
PZASMODZZMT-KULTUREN
.
88
3.4
ENZYMAKTIVITAETSTESTS
MIT
BEKANNTEN
REDOX-PROTEINEN
AUS
PLASMODIUM
FALCIPARUM
.
90
3.4.1
REDUKTION
VON
PEROXIDEN
DURCH
TRX
BZW.
GRX
.
90
3.4.2
REDUKTION
VON
DHA
DURCH
DAS
TRX-SYSTEM
BZW.
GRX
.
90
3.4.3
REDUKTION
VON
LIPONSAEURE/LIPONAMID
.
92
3.5
PFAOP
.
94
3.5.1
IDENTIFIZIERUNG
DER
SEQUENZ
VON
AOP
.
94
3.5.2
KLONIERUNG
DES
AOP-GENS
.
95
3.5.3
KLONIERUNG
UND
UEBEREXPRESSION
DER
VERKUERZTEN
SEQUENZ
AOPOS
.
95
3.5.4
DTNB-TITRATION
MIT
AOPOS
.
96
3.5.5
QUALITATIVE
UNTERSUCHUNGEN
MIT
AOPOS
.
97
3.5.6
KLONIERUNG
DER
SEQUENZ
FUER
DAS
YYREIFE
"
AOP
.
97
3.5.7
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
AOPSK
.
98
3.5.8
DTNB-TITRATION
MIT
AOPSK
.
98
3.5.9
ENZYMKINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
AOPSK
.
99
3.5.10
PH-VERHALTEN
.
102
3.5.11
REDUKTION
VON
AOPSK
DURCH
PLRX
.
103
3.5.12
QUALITATIVE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTION
VON
AOPSK
.
106
3.5.13
OLIGOMERISIERUNG
/
FPLC-VERHALTEN
.
107
3.5.14
KRISTALLISATION
.
108
INHALTSVERZEICHNIS
IV
3.5.15
INTRAZELLULAERES
T
ARGETING
.
110
3.6
CHARAKTERISIERUNG
DES
ERWEITERTEN
SUBSTRATSPEKTRUMS
DER
PF
THIOREDOXINPEROXIDASE
1
(PFTPXL)
.
111
3.6.1
ERMITTLUNG
DER
GRX-ABHAENGIGEN
PEROXIDASE-AKTIVITAET
DER
PFTPXL
.
111
3.6.2
REDUKTION
DER
PFTPXL
DURCH
PFPLRX
.
113
3.6.3
FESTSTELLUNG
DER
DHA-REDUKTASE-AKTIVITAET
VON
PFTPXL
.
115
3.6.4
MUTAGENESE
ZU
DEN
FORMEN
C74A
UND
C170A
.
117
3.6.5
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTEN
.
118
3.6.6
UNTERSUCHUNG
DER
OLIGOMERISIERUNG
DER
PFTPXL
.
120
3.7
UNTERSUCHUNG
DER
HEMMUNG
VERSCHIEDENER
(PF-)PROTEINE
DURCH
HAEMIN
(FERRIPROTOPORPHYRIN
IX,
FPIX)
.
122
3.7.1
HEMMUNG
DER
GLUTATHIONREDUKTASEN
DURCH
FPIX
.
122
3.7.2
HEMMUNG
DER
PF-THIOREDOXINREDUKTASE
DURCH
FPIX
.
124
3.7.3
HEMMUNG
VON
PF-GLUTAREDOXIN
DURCH
FP
.
126
4
DISKUSSION
.
128
4.1
THIOREDOXINE
UND
THIOREDOXIN-AEHNLICHE
PROTEINE
AUS
PLASMODIUM
FALCIPARUM
.
128
4.1,1
THIOREDOXIN-LIKE
PROTEIN
1
(TLPL)
.
129
4.1.2
THIOREDOXIN-LIKE
PROTEIN
2
(TLP2)
.
131
4.1.3
THIOREDOXIN
2
(TRX2)
UND
THIOREDOXIN
3
(TRX3)
.
132
4.2
PFTRXR
-
GENVARIATION
UND
HEMMUNG
.
138
4.2.1
N-TERMINAL
VERAENDERTE
TRXR-FORMEN
.
138
4.2.2
INHIBITOREN
DER
PFTRXR
.
139
4.3
INTERAKTIONEN
VON
THIOREDOXIN
1
UND
GLUTAREDOXIN
AUS
PF
.
141
4.3.1
INTERAKTION
MIT
PEROXIDEN
.
141
4.3.2 INTERAKTION
MIT
DEHYDROASCORBAT
.
142
4.3.3
INTERAKTION
MIT
LIPONSAEURE/-AMID
.
145
4.4
PFAOP
(ANTIOXIDANT
PROTEIN)
-
EIN
TYPV-PRX
.
147
4.4.1
IDENTIFIZIERUNG
DER
REIFEN
PROTEINSEQUENZ;
REDUKTIONSZUSTAND.
147
4.4.2
PEROXIDASE-AKTIVITAET
UND
SUBSTRATSPEZIFITAET
.
148
4.4.2.1
REDUZIERENDE
SUBSTRATE;
KINETISCHER
VERGLEICH
MIT
VERWANDTEN
PROTEINEN
148
4.4.2.2
OXIDIERENDE
SUBSTRATE
.
150
4.4.3
OLIGOMERISIERUNGSZUSTAND
.
153
4.4.4
ROENTGENSTRUKTUR
.
154
4.4.5
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
.
155
4.5
WEITERE
CHARAKTERISIERUNG
DER
PF-THIOREDOXINPEROXIDASEL
(TPXL)
.
159
4.5.1
SUBSTRATSPEZIFITAET
.
159
4.5.1.1
GLUTAREDOXIN
.
159
4.5.1.2
PLASMOREDOXIN
.
160
4.5.1.3
DEHYDROASCORBAT
.
161
4.5.2
BEDEUTUNG
DER
CYSTEINRESTE
C74
UND
C170
.
161
4.5.3
OLIGOMERE
DER
TPXL
.
165
4.6
HEMMUNG
VON
PF-ENZYMEN
DURCH
FERRIPROTOPORPHYRIN
IX
.
167
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
171
6
LITERATUR
.
173
6.1
LITERATURVERZEICHNIS
.
173
6.2
EIGENE
VEROEFFENTLICHUNGEN
.
197
6.3
COMPUTERPROGRAMME
.
199
6.3.1
SCHNITTSTELLENSUCHE
.
199
6.3.2
SEQUENZUEBERSETZUNG
DNA
-
PROTEIN
.
199
INHALTSVERZEICHNIS
V
6.3.3
BLASTS
.
199
6.3.4
PROTEINPARAMETER
.
199
6.3.5
ALIGNMENTS
.
A
.
199
6.3.6
SIGNALPEPTIDVORHERSAGE
.
199
6.3.7
VORHERSAGE
DER
APICOPLAST-LOKALISATION
.
199
6.3.8
VORHERSAGE
DER
MITOCHONDRIUM-LOKALISATION
.
200
6.3.9
ANALYSE
DER
CODON
USAGE
.
200
6.3.10
HYDROPHOBIZITAETSPLOT
UND
TRANSMEMBRAN-VORHERSAGE
.
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6.3.11
KONSERVIERTE
DOMAENEN
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MODIFIKATIONEN
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| dewey-tens | 610 - Medicine and health |
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