Untersuchungen zu Apoptose und Proliferation pankreatischer beta-Zellen von Rattus norvegicus:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2004
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| adam_text | -_i- Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG 1
1.1. Diabetes mellitus Typ 1 01
1.2. Zelltod pankreatischer ß-Zellen bei experimentell induziertem D. m. Typ 1 von
Mäusen 02
1.3. Intrazelluläre Vorgänge bei der Apoptose pankreatischer ß-Zellen 04
1.4. Die Wirkung von Streptozotocin auf pankreatische ß-Zellen 07
1.5. Bekannte Elemente Wachstumsfaktor-induzierter Signalwege in pankreatischen ß-
Zellen 09
1.6. Glukose als Mitose-Induktor in pankreatischen ß-Zellen 12
1.7. Bekannte Varianten des PRL-Rezeptors von Rattus norvegicus und ihre Funktionen
14
1.8. Signalwege der verschiedenen bekannten Prolaktin-Rezeptor Varianten
15
1.9. Zielsetzung 17
II. MATERIAL UND METHODEN 18
II. 1. Chemikalien und Reagenzien 18
11.2. Medien, Puffer und Lösungen 20
11.3. Hemmstoffe 23
11.4. Wachstumsfaktoren 25
11.5. Antikörper 25
11.6. Primer 25
11.7. Kits 26
11.8. Verbrauchsmaterial 26
11.9. Geräte und Apparaturen 27
11.10. Software 28
II. 11. Biologisches Material 28
11.12. Zellkultur 28
11.13. Primärzeilpräparation 29
11.14. Proliferations-Experimente mit INS 1-Zellen (Thymidininkorporation) 30
11.15. Annexin-Fitc/Propidiumiodid-Färbung 31
- ii - Inhaltsverzeichnis
11.16. Ethidiumbronüd/Acridinorange-Färbungen 32
n.17. DNS-Fragmentierung 33
11.18. Proteinpräparation 33
II. 19. Bestimmung der Proteinkonzentration 34
n.20. Western Blot 34
11.21. KoimmunprSzipitation 35
11.22. Proliferations-Experimente mit Primärzellen: BrdU-Einbau 36
11.23. RNS-Extraktion 37
11.24. RT-PCR 37
n.25. PCR 37
III. ERGEBNISSE 39
III. 1. Untersuchungen zur Apoptosehemmung 39
III. 1.1. Etablierung eines Apoptose-Modells zum Diabetes mellitus Typ 1 39
III. 1. Untersuchungen zur Apoptosehemmung 39
in. 1.1. Etablierung eines Apoptose-Modells zum Diabetes mellitus Typ 1 39
III. 1.1.1. Dosisfindung anhand von Proliferations-Experimenten 39
III. 1.1.2. Nachweis von früh-apoptotischen Zellen bei STZ-Anwendung 40
HI. 1.1.3. Nachweis von spät-apoptotischen Zellen bei STZ-Anwendung42
III. 1.1.4. Nachweis apoptotisch fragmentierter DNS bei STZ-Anwendung 44
III. 1.2. Analysen zum Einfluss von Wachstumsfaktoren auf Streptozotocin-behandelte INS1-
Zellen 44
III. 1.2.1. Untersuchung zum Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren auf die
Thymidineinbaurate von STZ-behandelten INS 1 -Zellen 45
III. 1.2.2. Untersuchung zur Wirkung verschiedener Wachstumsfaktoren auf den Index früh-
apoptotischer Zellen 46
III.1.2.3. Untersuchung zur Wirkung verschiedener Wachstumsfaktoren auf den Index spät-
apoptotischer Zellen 47
III.2. Untersuchungen zur Wirkung von Prolaktin (PRL) auf INS 1 -Zellen 48
111.2.1. Untersuchungen zur PRL-Rezeptor-Expression in INS 1 -Zellen 49
111.2.2. Analyse des INS 1-Zellwachstums unter dem Einfluss von Prolaktin und Glukose51
111.2.3. Analyse der Wachstumskinetik PRL- und Glukose-behandelter INS 1 -Zellen 52
111.2.4. Untersuchungen zur Rolle von Glukose beim Synergismus mit Prolaktin 54
-iii- Inhaltsverzeichnis
111.2.4.1. Analyse des Zellwachstums nach dem Austausch von D-Glukose gegen den
Energielieferanten D-Fruktose 54
111.2.4.2. Analyse des Zellwachstums nach dem Austausch von Glukose gegen den nicht
verstoffwechselbaren Zucker 2-Desoxy-D-Glukose 55
IH.2.4.3. Analyse des Zellwachstums nach dem Austausch von D-Glukose gegen den nicht
verstoffwechselbaren Zucker 3-0-Methyl-D-Glukopyranose 56
HI.2.4.4. Untersuchungen des Zellwachstums nach dem Austausch von D-Glukose gegen
den nicht verstoffwechselbaren Zucker D-Mannoheptulose 57
III.2.4.5. Untersuchungen zum Effekt von D-Mannoheptulose auf Glukose-behandelte
Zellen 58
111.2.5. Untersuchungen zum Mechanismus der PRL-Wirkung bei INS 1 -Zellen 60
111.2.5.1. Nachweis der Aktivierung von Stat 5A/B durch PRL 60
111.2.5.2. Untersuchung des Mechanismus der PRL-stimulierten Proliferation anhand
spezifischer Inhibitoren 61
111.2.6. Analyse des Mechanismus des synergistischen Effektes von Glukose und Prolaktin
72
111.2.6.1. Analyse des Mechanismus des synergistischen Effektes von Glukose und Prolaktin
anhand verschiedener Inhibitoren. 72
111.2.6.2. Spezifitätskontrollen der Hemmungen von p70S6K, PKA, PKC und PKG 79
HI.2.6.2.1. Spezifitätskontrolle der Hemmung von p70S6K 80
IH.2.6.2.2. Spezifitätskontrolle der Hemmung von PKA, PKC und PKG 81
HI.2.6.3. Untersuchungen zur Verkürzung der Inkubationsdauer von PRL 82
III.2.6.4. Untersuchung zur Kinetik der Tyrphostin AG 490-Wirkung 84
111.2.7. Untersuchung zur Übertragbarkeit der Ergebnisse auf Primärzellen 85
DISKUSSION 88
IV. 1. Die ß-Zell-Linie INS 1 als in vitro-Modell 88
1V.2. Apoptose-Hemmung 89
IV.2.1. Der Gebrauch von Streptozotocin bei in vivo und in vitro Diabetes-Modellen 89
IV.2.2. Der Einfluss von Wachstumsfaktoren auf den Apoptose-Index STZ-behandelter INS-1
Zellen 91
IV.3. Der Nachweis PRL- und Glukose-aktivierter Signalwege und deren Beteiligung an der
synergistischen Wirkung beider Aktivatoren 91
-iv- Inhaltsverzeichnis
IV.3.1. Die Schwierigkeit der Analyse Induktor-spezifischer Signalwege bei INS 1 -Zellen
93
IV.3.2. PRL-vemüttelte Signalwege bei pankreatischen ß-Zellen 93
IV.3.3. Glukose-vermittelte Signalwege 94
IV.3.4. Der Synergismus von Glukose und Prolaktin 94
IV.4.4. Übertragung des Synergismus auf Primärzellen 96
IV.4. Ausblick: Die Anwendung von Wachstumsfaktoren zur Heilung von Diabetes mellitus
Typl 96
V. ZUSAMMENFASSUNG 98
VL LITERATURVERZEICHNIS 99
Vn. ANHANG 112
VII. 1. PRL-Rezeptor-cDNS-Sequenzen von Rattus norvegicus 112
VII.2. Abkürzungen 114
VÜLDANKSAGUNG 117
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