Bedeutung der Signalwege des transformierenden Wachstumsfaktors TGF-beta für Effekte von Lysophospholipiden auf epidermale und dermale Zellen:
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
Weißensee-Verl.
2003
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| Schriftenreihe: | Berliner Beiträge zur Pharmazie
4 |
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Datensatz im Suchindex
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|---|---|
| adam_text | INHALT
1 EINLEITUNG 3
1.1 Wundheilung 3
1.1.1 Sekretion von Wachstumsfaktoren im Wundheilungsprozess 3
1.1.2 Proliferative Wirkung von Wachstumsfaktoren 4
1.1.3 Migration als Antwort auf Wachstumsfaktoren 6
1.1.4 Einfluss von Wachstumsfaktoren auf die Apoptose 7
1.1.5 Phasen der Wundheilung 10
1.1.5.1 Exsudative Phase 11
1.1.5.2 Resorptive Phase, Fibroblastenaktivität und Neovaskularisierung 11
1.1.5.3 Reparative Phase und Reepithelialisierung 13
1.2 Transformierender Wachstumsfaktor-ß (TGF-ß) 15
1.2.1 TGF-ß Rezeptoren 17
1.2.2 Smad-Proteine 18
1.2.3 Inhibierung von Smad-Signalwegen 20
1.3 Lysophospholipide 21
1.3.1 Biosynthese und Metabolismus von S1P 21
1.3.2 Biosynthese und Metabolismus von LPA 23
1.3.3 Rezeptoren für Lysophospholipide 23
1.3.4 Intrazelluläre Wirkungen von S1P 26
1.4 Fragestellung und Zielsetzung 27
2 MATERIAL UND METHODEN 31
2.1 Material 31
2.1.1 Geräte 31
2.1.2 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien 32
2.1.3 Nährmedien und Lösungen 35
2.1.3.1 Zellkultur-Medien 35
2.1.3.2 Lösungen zur Zellkultivierung 36
2.1.3.3 Oligonukleotide 37
2.1.3.4 Lösungen zur Zell-Lyse 38
2.1.3.5 Lösungen für die Elektrophorese und Western-Blot-Analyse 40
2.1.3.6 Lösungen für die Apoptosebestimmungen 41
INHALT
2.2 Methoden 42
2.2.1 Kultivierung von Zellen 42
2.2.1.1 Gewinnung und Kultivierung humaner epidermaler und dermaler Zellen 42
2.2.1.2 Gewinnung und Kultivierung muriner epidermaler und dermaler Zellen 44
2.2.2 Lösungen der Testsubstanzen 45
2.2.3 Antisense-Untersuchungen 46
2.2.4 Gezieltes Ausschalten des Smad3-Gens 46
2.2.5 Analyse der mRNA-Transkription in epidermalen und dermalen Zellen 48
2.2.5.1 mRNA-lsolierung 48
2.2.5.2 cDNA-Synthese 50
2.2.5.3 Polymerasekettenreaktion 50
2.2.6 Spezifische Proteindetektion mittels Immun- oder Oligonukleotid-
präzipitation, SDS-Gelelektrophorese und Western Blot 52
2.2.6.1 Zell-Lyse und Immunpräzipitation 52
2.2.6.2 SDS-Gelelektrophorese 53
2.2.6.3 Western-Blot 53
2.2.6.4 Isolierung von Nuklei 54
2.2.6.5 Nachweis der Smad3-Phosphorylierung durch Bindung an
Oligonukleotide des Promoters Smad-responsiver Gene 55
2.2.6.6 Western Blot Analytik von PAI-1, Fibronektin, MMP-2, Bcl-2, Bax
sowie p42/44 MAPK aus Zell-Lysaten 56
2.2.6.7 Proteinbestimmung 58
2.2.6.8 Untersuchung der Exprimierung von Matrixproteinen durch
radioaktiv markiertes Methionin 59
2.2.7 Untersuchungen zur Zellproliferation 60
2.2.7.1 Bestimmung antiproliferativer Effekte an Keratinozyten und Melanozyten...60
2.2.7.2 Bestimmung proliferativer Effekte an Fibroblasten und Keratinozyten 60
2.2.8 Untersuchungen zur Migration 61
2.2.9 Durchflusszytometrische Bestimmung der Apoptoserate 61
2.2.9.1 Zellstimulation und -aufarbeitung 61
2.2.9.2 Einstellung des Durchflusszytometers und Messung 62
2.2.10 TUNEL-Färbung apoptotischer Zellen 64
2.2.11 Statistik 64
INHALT
3 ERGEBNISSE 67
3.1 Effekte von LPL auf wundheilungsmodulierende Parameter 67
3.1.1 Antiapoptotische Eigenschaften von S1P 67
3.1.1.1 Protektion humaner Keratinozyten gegen die TNF-a-induzierte Apoptose...67
3.1.1.2 Zytoprotektive Wirkung von S1P auf humane Fibroblasten 69
3.1.1.3 Einfluss von S1P auf Mitglieder der Bcl-2-Familie in
humanen Fibroblasten 71
3.1.1.4 Antiproliferative und antiapoptotische Eigenschaften von
1,25(OH)2VD3 und S1P in humanen Melanozyten 73
3.1.2 Beeinflussung kritischer Parameter der Wundheilung durch S1P
und LPA in Analogie zu TGF-ß 77
3.1.2.1 Expression von LPLR in intakter Haut 77
ZA.2.2 Expression von Smad2, 3 und 4 in humanen primären Keratinozyten
und Fibroblasten sowie intakter Haut 78
3.1.2.3 Einfluss von S1P und LPA auf die Migration muriner Keratinozyten 80
3.1.2.4 Einfluss von S1P und LPA auf die Proliferation muriner Keratinozyten 81
3.1.2.5 Steigerung der Proliferation muriner Fibroblasten durch LPL 82
3.1.2.6 Einfluss von LPL auf die Bildung von PAI-1 durch Fibroblasten 83
3.1.2.7 Einfluss von S1P und LPA auf die Bildung von Fibronektin 85
3.1.2.8 Beteiligung von spezifischen Rezeptoren an der PAI-1- und
Fibronektin-Bildung durch LPL 87
3.1.2.9 Einfluss von S1P, und SIP3 auf die Induktion von PAI-1 und
Fibronektin durch S1P 88
3.1.2.10 Steigerung der MMP-2-Synthese durch S1P und LPA 89
3.2 Einfluss von S1P und LPA auf den Smad-Signalweg 91
3.2.1 Etablierung einer Detektionsmethode für Smad-Proteine 91
3.2.2 Bestimmung der Proteinspiegel von Smad3 91
3.2.3 Phosphorylierung von Smad3 durch TGF-ß 92
3.2.4 Phosphorylierung von Smad3 durch S1P und LPA 93
3.2.5 Konzentrationsabhängigkeit der S1P- und LPA-induzierten
Smad3- Phosphorylierung 94
3.2.6 Aktivierung der MAPK Kaskade durch LPL 95
3.2.7 Bildung funktioneller Smad3/Smad4-Komplexe durch TGF-ß und LPL 96
INHALT
3.2.8 Translokation von Smad3/ Smad4 in den Nukleus 97
3.2.9 Bindung an Promoteren Smad3-responsiver Gene 99
3.2.10 Rezeptorvermittelte Smad3-Aktivierung durch S1P und LPA 100
3.2.11 Beteiligung von S1Pi und S1P3 an der Smad3-Aktivierung durch S1P 102
3.3 Bedeutung der Ausschaltung des Smad3-Signalweges für
Effekte von S1P und LPA 103
3.3.1 Wege zur Ausschaltung des Smad3-Signalweges 103
3.3.2 Wirkung von LPL auf die Proliferation von Smad3-KO- Fibroblasten 104
3.3.3 Smad3-unabhängige Induktion von Fibronektin durch LPL 105
3.3.4 Beteiligung von Smad3 an der Induktion von PAI-1 durch LPL 106
3.3.5 Beteiligung von Smad3 an den Effekten der LPL
auf die Keratinozytenproliferation 108
3.3.6 Beteiligung von Smad3 an der chemotaktischen Wirkung der LPL
auf murine Keratinozyten 109
4 DISKUSSION 113
4.1 Effekte von LPL auf wundheilungsmodulierende Parameter 113
4.1.1 Antiapoptotische Eigenschaften von S1P 113
4.1.2 Beeinflussung kritischer Parameter der Wundheilung durch
S1P und LPA in Analogie zu TGF-ß 118
4.2 Aktivierung des Smad3-Signalweges durch LPL 124
4.3 Bedeutung der Ausschaltung des Smad3-Signalweges für
Effekte von S1P und LPA 129
4.4 Ausblick 133
5 ZUSAMMENFASSUNG 137
6 LITERATURVERZEICHNIS 141
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