Klonierung und pharmakologische Charakterisierung von Corticotropin-Releasing-Factor (CRF) Rezeptoren aus einem Lachs (Oncorhynchus keta):
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2002
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KLONIERUNG UND PHARMAKOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG
VON CORTICOTROPIN-RELEASING-F ACTOR (CRF) REZEPTOREN
AUS EINEM LACHS {ONCORHYNCHUS KETA)
VON DER GEMEINSAMEN NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER TECHNISCHEN
UNIVERSITAET CARPLO-WILHELMINA ZU BRAUNSCHWEIG ZUR ERLANGUNG DER GRADES
EINER
DOKTORIN DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
GENEHMIGTE
DISSERTATION
SIGRUN POHL
BREMEN
IMAGE 2
INHALT: CHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN UND KONVENTIONEN 1
1. EINLEITUNG 1.1 PHYSIOLOGIE UND PHARMAKOLOGIE DES
CORTICOTROPIN-RELEASING-F ACTORS 5 1.2 MOLEKULARBIOLOGIE VON CRF UND
VERWANDTEN NEUROPEPTIDEN 7
1.3 BINDUNGSSTELLEN VON CRF 9
A. MOLEKULARBIOLOGISCHE CHARAKTERISTIKA DER CRF-REZEPTOREN UND DEREN
SIGNALTRANSDUKTION 10
B. EXPRESSION DER CRF-REZEPTOREN 11
C. PHARMAKOLOGIE DER CRF-REZEPTOREN 12
D. REGULATION DER REZEPTORFUNKTION (STRESS UND DEPRESSION) 14 1.4 FISCHE
ALS MODELLSYSTEM 16
1.5 NEUROANATOMIE UND ENDOKRINOLOGIE DER FISCHE 17
1.6 STRESSREAKTIONEN BEIM KNOCHENFISCH 19
2. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 21
3. MATERIAL UND METHODEN 3.1 MATERIAL 23
3.1.1 BEZUGSQUELLEN 23
3.1.2 BAKTERIENSTAEMME 24
3.1.3 V E K T O R EN 24
3.1.4 N AE H R M E D I EN 25
3.1.5 PUFFER U ND LOESUNGEN 26
3.2 M E T H O D EN 28
3.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 28
3.2.1.1 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA 28
3.2.1.2 EXTRAKTION UND PRAEZIPITATION VON NUKLEINSAEUREN 28
3.2.1.3 REVERSE TRANSKRIPTION VON RNA ZU EINZELSTRANG-CDNA 29
3.2.1.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION 29
A. GENERELLE REAKTIONSBEDINGUNGEN 29
B. KLONIERUNG VON CDNA IN VOLLER LAENGE 30
3.2.1.5 RACE (RAPIDAMPLIFICATION OFCDNA ENDS) 30
3.2.1.6 REAL-TIME TAQMAN* QUANTITATIVE PCR 31
3.2.1.7 DURCHMUSTERN VON CDNA-BIBLIOTHEKEN 32
A. TITRATION VON CDNA-BIBLIOTHEKEN 32
B. AUSPLATTIEREN VON CDNA-BIBLIOTHEKEN 32
C. TRANSFER DER PHAGEN-DNA AUF NITROZELLULOSEFILTER 32
D. HYBRIDISIERUNG MIT NUKLEINSAEURESONDEN 33
E. IN TW»-EXZISION DER KLONIERTEN CDNA 33
3.2.1.8 HERSTELLUNG VON RADIOAKTIV MARKIERTEN NUKLEINSAEURESONDEN 33
3 2.1.9 ANALYSE VON NUKLEINSAEUREN 34
A. RNA-GELELEKTROPHORESE 34
B. IMMOBILISIERUNG UND TRANSFER VON RIBONUKLEINSAEUREN (NORTHERN BLOT) 34
C. HYBRIDISIERUNG MIT RADIOAKTIVEN SONDEN 34
D. DNA-GELELEKTROPHORESE 34
E. SEQUENZIERUNG 35
3.2.1.10 KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 35
A. VERDAU MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 35
B. DE-/PHOSPHORYLIERUNG 35
C. LIGATION 35
D. HERSTELLUNG UND VERWENDUNG (TRANSFORMATION) KOMPETENTER ZELLEN 35
3.2.1.11 ANALYSE VON DNA-FRAGMENTEN 36
A. IDENTIFIKATION UND SELEKTION REKOMBINANTER KLONE 36
B. COLMY-LIFTS 36
C. GROESSENBESTIMMUNG UND SEQUENZIERUNG DER SUBKLONIERTEN DNA-FRAGMENTE 36
3.2.1.12 PRAEPARATION VON D NA 37
A. MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA 37
B. MIDIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA 37
C. MAXIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA 37
3.2.1.13 VERGLEICHE VON DNA-/AMINOSAEURESEQUENZEN UND DATENBANKSUCHE 38
3.2.1.14 IN T/VRO-TRANSKRIPTION VON RNA 38
3.2.2 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE METHODEN 39
3.2.2.1 EXPRESSION VON IN WVRO-TRANSKRIBIERTER RNA (CRNA) IN XENOPUS
LAEVIS-OOCYTEN 39
3.2.2.2 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE MESSUNGEN UND AUSWERTUNG 39
3.2.3 ZELLPHYSIOLOGISCHE METHODEN 40
3.2.3.1 KULTIVIERUNG VON EUKARYONTISCHEN ZELLEN 40
3.2.3.2 TRANSFEKTION VON HEK 293-ZELLEN 40
3.2.3.3 HERSTELLUNG VON STABIL TRANSFIZIERTEN ZELLINIEN 40
3.2.3.4 BESTIMMUNG VON INTRAZELLULAEREM CAMP AUS HEK 293-ZELLEN 40 A.
AKTIVIERUNG DER ADENYLYLCYCLASE MIT LIGANDEN 41
B. EXTRAKTION VON INTRAZELLULAEREM CAMP AUS HEK 293-ZELLEN 41 3.2.3.5
ERSTELLEN VON KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-KURVEN 41
3.2.3.6 BESTIMMUNG VON LIGANDENBINDUNG 41
3.2.3.7 ISOLIERUNG VON ZELLMEMBRANEN 41
3.2.3.8 PROTEINBESTIMMUNG 42
3.2.3.9 LIGAND-/REZEPTOR-BINDUNGSEXPERIMENT 42
3.2.3.10 ANALYSE DER KOMPETITIONSBINDUNG 42
4. ERGEBNISSE 4.1 KLONIERUNG VON CRF-REZEPTOREN (CDNA) AUS ONCORHYNCHUS
KETA 43 4.1.1 KLONIERUNG DER VOLLSTAENDIGEN C D NA DES CRF RL AUS
ONCORHYNCHUS KETA 43
4.1.2 KLONIERUNG DER VOLLSTAENDIGEN C D NA DES CRF R2 AUS ONCORHYNCHUS
KETA 46
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.2 ANALYSE DER SCRF RL- UND SCRF R2-PROTEINE 49
4.3 TRANSFEKTION VON HEK 293-ZELLEN MIT SCRF RL- UND SCRF R2-CDNA 53 4.4
FUNKTIONELLE AKTIVITAET AUSGEWAEHLTER SCRF RL- UND SCRF R2-ZELL- KLONE UND
UEBERPRUEFUNG DER CRF-REZEPTOR-LIGANDEN 55
4.5 KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-KURVEN AUSGESUCHTER AGONISTEN AN DEN SCRF
RL#7 UND SCRF R2#4 59
4.6 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG 62
4.6.1 COEXPRESSION DER CRF-REZEPTOREN MIT GIRK1 63
4.6.2 COEXPRESSION DER CRF-REZEPTOREN MIT G AL6-PROTEIN 65 4.7
UNTERSUCHUNG DER BINDUNGSAFFINITAET VON CRF UND UROTENSIN I ZU DEN
CRF-REZEPTOREN AUS ONCORHYNCHUS KETA IM VERGLEICH ZUM CRF RL DER RATTE
67
4.8 UNTERSUCHUNGEN ZUR ORGANSPEZIFISCHEN VERTEILUNG DER CRF-REZEPTOR-
TRANSKRIPTE AUS ONCORHYNCHUS KETA 10
4.9 EINFLUSS UNTERSCHIEDLICHER STRESSOREN AUF DIE CRF RL MRNA-QUANTITAET
VON ONCORHYNCHUS TSHAWYTSCHA 73
4.9.1 VALIDIERUNG DER PRIMERKONZENTRATION: PRIMERMATRIX 74
4.9.2 PRIMER-LIMITIERUNG 77
4.9.3 BESTIMMUNG DER REAKTIONSEFFIZIENZEN EINER MULTIPLEX-PCR 78 4.9.4
RELATIVE QUANTIFIZIERUNG DER C D NA DES SCRFRL 79
5. DISKUSSION
5.1 PHYLOGENETISCHE BETRACHTUNG 81
5.2 EXPRESSION DER CRF-REZEPTOR-GENE 84
5.3 TRANSFEKTION UND ZELLSYSTEME 85
5.4 FUNKTIONELLE UND PHARMAKOLOGISCHE BETRACHTUNGEN 86
A. BEDEUTUNG DER ZELLANTWORT 86
B. EINSCHAETZUNG DER BINDUNGSSPEZIFITAET VON UROTENSIN I 89
5.5 EINFLUSSGROESSEN DER FUNKTIONELLEN UND PHARMAKOLOGISCHEN
CHARAKTERISIERUNG 91
5.6 TENDENZ DER PHYSIOLOGISCHEN BEDEUTUNG DES CRF R1 93
5.7 GESAMTBEURTEILUNG DER KLONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER
CRF-REZEPTOREN AUS ONCORHYNCHUS KETA UND HYPOTHESE 94
6. ZUSAMMENFASSUNG 95
ABKUERZUNGEN UND KONVENTIONEN
ANHANG AI: OLIGONUKLEOTIDE A2: PLASMIDE A3: RCRF RL-ZELLKLONE
(CAMP-WERTE)
A4: SS-AKTIN-CDNA-SEQUENZ
LITERATURVERZEICHNIS
LEBENSLAUF
99
100 102 103
105
117
KONVENTIONEN
A M I N O S AE U R EN A ALA
CYS ASP GLU PHE
GLY HIS ILE LYS LEU
MET ASN PRO GIN ARG SER THR
VAL TRP
TYR
C D E F
G H I K
L M N P
Q R S T V W Y
ALANIN CYSTEIN ASPARAGINSAEURE GLUTAMINSAEURE
PHENYLALANIN
GLYCIN HISTIDIN ISOLEUCIN LYSIN
LEUCIN METHIONIN ASPARAGIN PROLIN GLUTAMIN ARGININ
SERIN THREONIN VALIN TRYPTOPHAN
TYROSIN
NUKLEOTIDE A C G
T U ATP CTP
GTP TTP
(D-:2
ADENOSIN CYTIDIN GUANOSIN THYMIDIN URACIL ADENOSINTRIPHOSPHAT
CYTIDINTRIPHOSPHAT GUANOSINTRIPHOSPHAT THYMID INTRIPHOSPHAT
-DESOXY-)
(R-: RIBO-)
ABKUERZUNGEN
AC ACTH AS AVP
BNST B P BQ
BSA
CAP
CDNA CHO
CI CMV COS
ACETAT ADRENOCORTICOTROPES HORMON AMINOSAEUREN ARGININ-VASOPRESSIN
ENGL. HED NUDEUS OF THE STRIA TERMINALIS
BASENPAARE BECQUEREL; 1 ZERFALL PRO SEKUNDE ENGL. BOVINE SERUM ALBUMINE,
ALBUMINE VOM RIND
PL-5 -/7-METHYL)-GUANOSIN-P3-5 -GUANOSINTRIPHOSPHAT,
M7G(5 )PPP(5 )G KOMPLEMENTAERE DESOXYRIBONUKLEINSAEURE
ENGL. CHINESE HAMSTER OVARY CURIE; 3,7 X 10 10 BQ CYTOMEGALOVIRUS ENGL.
AFRICAN GREEN MONKEY KIDNEY
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