Grün fluoreszierendes Protein und gezielte Genstillegung in Chlamydomonas reinhardtii: Wege zur Funktionsanalyse bekannter Proteine am Beispiel des Photorezeptors Chlamyrhodopsin
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2000
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- 3
GRUEN FLUORESZIERENDES PROTEIN UND GEZIELTE GENSTILLEGUNG
IN CHLAMYDOMONAS REINHARDTII
WEGE ZUR FUNKTIONSANALYSE BEKANNTER PROTEINE AM BEISPIEL DES
PHOTOREZEPTORS CHLAMYRHODOPSIN
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET III - BIOLOGIE UND VORKLINISCHE
MEDIZIN -
DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON MARKUS FUHRMANN AUS TEUBLITZ 2000
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS .-. 1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 3
1. ZUSAMMENFASSUNG 5
2. EINLEITUNG 9
PHOTOREZEPTION UND RETINALPROTEINE IN MIKROALGEN 9
BIOLUMINESZENZ UND GRUEN FLUORESZIERENDES PROTEIN 12
HOMOLOGE REKOMBINATION ALS MITTEL ZUR GEZIELTEN GENZERSTOERUNG 18
PHAENOMENE DER GENSTILLEGUNG DURCH ANTISENSE -EFFEKTC 21
ZIELE DIESER ARBEIT 25
3. ERGEBNISSE 27
3.1 EXPRESSION VON GRUEN FLUORESZIERENDEM PROTEIN (GFP) IN CHLAMYDOMONAS
REINHARDTII 27
3.1.1 GENSYNTHESE UND EXPRESSION IN E. COLI 27
3.1.2 EXPRESSION VON CGFP IN CHLAMYDOMONAS 33
3.1.2.1 EXPRESSION ALS FUSIONSPROTEIN MIT DEM ZEOCIN-BINDEPROTEIN BLE 33
3.1.2.2 EXPRESSION ALS FUSIONSPROTEIN MIT CHLAMYOPSIN 40
3.1.2.3 WEITERE MARKIERUNGEN MIT CGFP IN GRUENALGEN 43
3.2 UEBEREXPRESSION VON CHLAMYRHODOPSIN 44
3.2.1 ISOLIERUNG DES GENS UND ALTERNATIVES SPLEISSEN 44
3.2.2 UEBEREXPRESSION IN CHLAMYDOMONAS 48
3.2.2.1 ANSAETZE ZUR EXPRESSION DER CDNA 48
3.2.2.2 ANSAETZE ZUR EXPRESSION MIT DEM GESAMTEN GEN 49
3.2.2.3 COP-UEBEREXPRESSION IN TRANSFORMANTET74E10 51
3.3 REDUKTION DER EXPRESSION VON CHLAMYRHODOPSIN 56
3.3.1 HOMOLOGE REKOMBINATION ALS MITTEL ZUR GENZERSTOERUNG 56
3.3.1.1 KEINE SELEKTION AUF HOMOLOGE REKOMBINATION 56
3.3.1.2 SELEKTION MIT EINEM MARKER 59
3.3.1.3 SELEKTION MIT ZWEI UNABHAENGIGEN MARKERN 61
3.3.2 KOMPLEMENTAERE (ANTISENSE-) RNA ZUR REDUKTION DER GENEXPRESSION 62
3.3.2.1 EINFACHE ANTISENSE-ANSAETZE 63
3.3.2.2 ANSAETZE MIT SELBSTKOMPLEMENTAEREN STRUKTUREN 64
3.3.2.3 TRANSFORMANTEN MIT REDUZIERTER MENGE AN COP 66
4. DISKUSSION 69
4.1 SYNTHETISCHE GENE ALS MOLEKULARE HILFSMITTEL 69
4.2 HOMOLOGE REKOMBINATION IN GRUENALGEN 74
4.3 ALTERNATIVEN ZUR GENZERSTOERUNG: KOMPLEMENTAERE RNA ZUR HEMMUNG VON
GENAUSPRAEGUNG IN CHLAMYDOMONAS 78
4.4 FUNKTIONSANALYSE DER COP-GENPRODUKTE 81
4.4.1 DIE NEUE SPLEISSVARIANTE COP2 81
4.4.2 ANALYSE DER MUTANTEN MIT VERAENDERTEM COP-GEHALT 87
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
5. MATERIAL UND METHODEN 93
5.1 KULTURZUCHT 93
5.1.1 ANZUCHT UND LAGERUNG VON CHLAMYDOMONAS REINHARDTII 93
5.1.1.1 MEDIEN 94
5.1.1.2 ZUCHT VON ZELLEN ZUR TRANSFORMATION, DNA- UND PROTEINANALYSE 95
5.1.1.3 LAGERUNG VON STAMMKULTUREN UND TRANSFORMANTEN 95
5.1.2 ANZUCHT UND LAGERUNG VON ESCHERICHIA COLI 95
5.1.2.1 MEDIEN 95
5.1.2.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER ESCHERICHIA COLI UND TRANSFORMATION 96
5.1.2.3 LANGZEITLANGERUNG VON ESCHERICHIA COLI 96
5.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 97
5.2.1 GENSYNTHESE 97
5.2.2 ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN 98
5.2.2.1 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS CHLAMYDOMONAS REINHARDTII 98
5.2.2.2 ISOLIERUNG VON RNA AUS CHLAMYDOMONAS REINHARDTII 98
5.2.2.3 ISOLIERUNG VON PLASMID DNA AUS ESCHERICHIA COLI 99
5.2.3 NACHWEIS UND ANALYSE VON NUKLEINSAEUREN 99
5.2.3.1 DNA-SEQUENZIERUNG 99
5.2.3.2 DNA UND RNA NACHWEISE DURCH HYBRIDISIERUNG MIT DIG-MARKIERTEN
DNA-SONDEN 99
5.2.3.3 SPALTUNG VON DNA DURCH RESTRIKTIONSENZYME 100
5.2.3.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION 100
5.2.4 KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN IN PLASMID-VEKTOREN 101 5.2.5
ORTSGERICHTETE MUTAGENESE 102
5.2.6 TRANSFORMATION VON CHLAMYDOMONAS 102
5.3 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 103
5.3.1 FRAKTIONIERUNG VON PROTEINEN AUS CHLAMYDOMONAS REINHARDTII 103
5.3.2 ANALYSE VON PROTEINGEMISCHEN 104
5.3.2.1 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 104
5.3.2.2 PROTEIN-IMMUNOBLOTS 104
5.3.3 REINIGUNG VON HISTIDIN-MARKIERTEN REKOMBINANTEN PROTEINEN UEBER NI
-NTA- SUPERFLOW-MATRIX 105
5.3.4 SDS-PAGE 106
5.3.5 ORGANISCHE EXTRAKTION VON RETINAL 106
5.4 BIOPHYSIKALISCHE UND PHYSIOLOGISCHE METHODEN 106
5.4.1 ABSORPTIONS- UND FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE 106
5.4.2 FLUORESZENZMIKROSKOPIE UND BILDVERARBEITUNG 107
5.4.3 ELEKTROPHYSIOLOGIE, BEWEGUNGSANALYSE UND PHOTOTAXISMESSUNG 107 5.5
MATERIAL 108
5.5.1 STAEMME 108
5.5.2 PLASMIDE 109
5.5.3 BIOCHEMIKALIEN UND ENZYME 109
5.5.4 OLIGONUKLEOTIDE 111
5.5.5 LOESUNGEN 112
6. LITERATURVERZEICHNIS 114
7. LEBENSLAUF 125
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