Modifikation des Sekundärstoffwechsels von Pflanzen durch Stilbensynthase im Hinblick auf eine mögliche Anwendung in der Pflanzenzüchtung:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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Aachen
Shaker
1999
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| Schriftenreihe: | Berichte aus der Biologie
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| adam_text | Titel: Modifikation des Sekundärstoffwechsels von Pflanzen durch Stilbensynthase im Hinblick auf eine mög
Autor: Teuschel, Ute
Jahr: 1999
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkiirzungsverzeichnis V
Zusammenfassung VI
1 EINLEITUNG 1
1.1 Der Phenylpropan-Stoffwechsel 2
1.1.1 Der allgemcine Phenylpropan-Stoffwechsel 2
1.1.2 Die Seitenwegc des Phenylpropan-Stoffwechsels 5
1.2 Der Flavonoid-Stofrwechsel 8
1.2.1 Funktion und Bedeutung 8
1.2.2 Die Chalkonsynthase 8
1.2.3 Anthocyanin-Synthese in Petunie 9
1.2.4 Die Flavonole - Synthese und Bedeutung fur die Fertilitat i 1
13 Die Stilbene 12
1.3.1 Vorkommen und Bedeutung 12
1.3.2 Die Stilbensynthase 13
1.3.3 Das KMi-Gen 14
1.3.4 Die Expression chimarer Stilbensynthase-Gene in Tabak 15
1.4 Minnliche SterilitSt and Hybridsaatgut 17
1.4.1 Bedeutung von Hybridsaatgut 17
1.4.2 Mechanismen zur Herstellung von Hybridsaatgut 17
1.4.3 Gentechnische Ansatee zur Erzeugung von mannlicher Sterilitat 19
1.5 Die Cosuppression 20
1.5.1 Der Begriff Cosuppression 20
1.5.2 Modell fur Cosuppression durch posttranskriptionale RNA-Degradation 21
1.6 Das Ziel der Arbeit 22
Inhaltsverzeichnis________
24
2 MATERIAL
24
2.1 Pflanzenmatenal
24
2.2 BakterieratSmme
2.2.1 Escherichia co/i-Stamme
2.2.2 Agrobacterium lumefaciefis-Stamme
25
23 Krankhetaerreger
25
2.4 Elicitoren
26
2.5 Nukleins3uren
26
2.5.1 Plasmide
2.5.2 Binare Vektoren
2.5.3 Oligonukleotide
30
2.6 Medien
30
2.6.1 Bakterienmedien
2.6.2 Pflanzenmedien
2.7 Chemikalien 31
3 METHODEN 32
3.1 I lasmidkonstruktionen 3
32
3.1.1 Das naMj-Gen unter der Kontrolle des CaMV 35S RNA Promoters
3.1.2 Das Vstl-Gen mit/ohne Antheren-Box und Enhancer
3.1.3 Das VstlGUS-Gen mit/ohne Antheren-Box
34
3.2 Transformation von Tabak and Perunie darch A. tumefaciens
34
3.2.1 Herstellung der Agrobakterien-Stamme
3.2.2 A. tumefaciens-vemntielts Transformation
3.2.3 Nachweis der T-DNA in transgenen Pflanzen
3.3 Pflanzcnanzucht
3.3.1 Sterile SproBkulturen und Pflanzenanzucht im Gewachshaus
3o
3.3.2 Tabaksuspensionskulturen
37
3.4 Bliiien- und Kaoiipcnstadien
37
3.4.1 Biiiten- und Knospenstadien bei Petunia hybrida (PH)
3.4.2 Biiiten- und Knospenstadien bei Nicoliana tabacum (NT)
Inhaltsverzeichnis
3.5 Methoden zum IVachweis von DNA und RNA 38
3.5.1 Nachweis von binaren Vektoren in Agrobakterium-Stammen 38
3.5.2 Northern Blot Analyscn 39
3.5.3 Herstellung einer Sonde zum Nachweis der Chalkonsynthase in Tabak 40
3.5.4 Sequenzierung 40
3.5.5 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 41
3.6 Bestimmung spezifischer Enzy maktivitat 42
3.6.1 JJ-Glucuronidase-Aktivitat 42
3.6.2 Stilbensynthase- und Chalkonsynthase-Aktivitat 42
3.6.3 Flavanon 3-Hydroxylase-Aktivitat 43
3.6.4 Salicylathydroxylase-Aktivitat 44
3.7 Histologische und mikroskopische Untersuchungen 44
3.7.1 Pollen-Analyse 44
3.7.2 Antheren-Querschnitte 45
3.7.3 Antheren-Quetschpraparate 45
3.7.4 Beobachtung von Biattern unter UV-Licht 46
3.7.5 Phlorogluzin-Salzsaure-Farbung 46
3.8 Ana/yrische Methoden 46
3.8.1 Nachweis von Flavonolen 46
3.8.2 Anthocyanin-Gehalt in Bluten 46
3.8.3 HPLC von Petalenextrakten zum Nachweis von Anthocyaninen 46
3.8.4 Absorption und Fluoreszenz von Blattextrakten 47
3.9 Physiologische Untenuchungsmethoden 47
3.9.1 Samenbildung und Samenkeimung 47
3.9.2 Supplementationsexperimente an Petunienpetalen 48
3.9.3 Versuche zur Induktion von mannlicher Sterilitat 48
3.10 Phytopathologische Untersuchungen 49
3.10.1 Infektion von Tabak mit dem Tabakmosaikvirus (TMV) 49
3.10.2 Inokuiation von Tabak rait Botrytis cinerea 50
4 ERGEBMSSE SI
4.1 Taperumspezifische Srilbensyntbase-Eipresaion in Petunie 51
4.1.1 Herstellung transgener Pflanzen und phanotypische Charakterisierung 51
4.1.2 Akkumulation von STS- und CHS-Transkripten in Petunienknospen 53
4.1.3 Untersuchung der Pollenentwicklung 55
Inhaltsverzeichnis
4.2 Konstitutive Stilbensynthase-Expression in Petunie 56
4.2.1 Herstellung transgener Pflanzen und phanotypische Chaiakterisierang 56
4.2.2 Untersuchung dcs veranderten Blutenphanotyps 58
4.2.3 Molekularbiologische Ursachen fiir die veranderte Bliitenfarbe und ver-
minderte mannliche Fertilitat - Verglcich von CHS- und STS-Expression 64
4.2.4 Die altersabhangige Expression von STS und CHS 69
4.2.5 Untersuchungen weiterer Enzyme des Anthocyan-Stoffwechsels 71
4.2.6 Effekte der konstitutiven STS-Expression auf die weibliche Fertilitat 74
4.2.7 Phanotypische Charakterisierung der Nachkommen 74
4.2.8 Untersuchung von Petunienlinien mit instabilem Phanotyp 78
4.3 EinfluB der konstitutiven STS-Expression in transgenen Tabakpflanzen
auf die endogene CHS-Akrhitat und den veranderten BIBtenphSnotyp 82
4.3.1 CHS-und STS-Enzymaktivitat in Tabakpetalen 82
4.3.2 Isolierung von Tabak-CHS cDNA-Fragmenten 83
4.3.3 Chalkonsynthase mRNA-Akkumulation in Tabakpetalen 85
4.4 Induzierbare minnliche SterilitSt durch die Expression von STS
nnter der Kontrolle des naturlichen Vstl-Promotors 86
4.4.1 Versuche ziir Induktion von mannlicher Sterilitat bei Tabak 86
4.4.2 EinfluB von Salicylat auf die Induktion von STS in Tabak 87
4.4.3 Erhohung der gewebespezifischen STS-Expression in Tabak und Petunie
durch die Integration der Antheren-Box in den Vstl -Promoter 93
5 DISKUSSION 103
5.1 F.influsse der STS-Expression auf den Sekundarstoflwechsel von Pflanzen 104
5.1.1 Die heterologe STS-Expression in Petunie 104
5.1.2 Der durch STS-Expression veranderte Habitus transgener Pflanzen 106
5.1.3 Die Cosuppression von STS und CHS in transgenen Petunien 109
5.1.4 Die Stabilitat der durch STS-Expression verursachten Phanotypen HI
5.1.5 Der Vergleich der STS-Expression in Tabak und Petunie *14
5.1.6 Der veranderte Flavonoid-Stoffwechsel 117
5.1.7 Die veranderte Fertilitat 120
5.1.8 Modell zu den Einfliissen der heterologen STS-Expression auf den
Stoffwechsel und die Physiologie von transgenen Pflanzen 123
5.2 Eine mSgiiche Anwenduog von STS bei der Hentellnng von Hybridsaatgut 124
6 LITERATURVERZEICHNIS 128
Anhang A I47
Anhang B 15°
IV
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