Untersuchungen zum Wirkmechanismus bakterieller Exotoxine an humanen Endothelzellen:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Wettenberg
VVB Laufersweiler
1999
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
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1 VORWORT 1
2 EINLEITUNG UND FRAGESTELLUNG 1
2.1 Physiologische Funktionen der Endothelzelle 1
2.2 Endotheliale Signal-Transduktionswege im Rahmen einer Inflamma-
torischen Zellaktivierung - (G-Proteine, second messenger) 3
2.3 Freisetzung inflammatorischer Lipidmediatoren aus aktivierten
Endothelzellen 6
2.3.1 Prostazyklin (PGI2) 6
2.3.2 Plättchen-aktivierender Faktor (PAF) 8
2.4 Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) aus aktivierten Endothelzellen 11
2.5 Das pathophysiologische Konzept porenbildender bakterieller Exotoxine 12
2.6 Charakterisierung und klinische Bedeutung des
E. coli Hämolysins (HlyA) 13
2.7 Charakterisierung und klinische Bedeutung des
Staphylococcus aureus a-Toxin 14
2.8 Fragestellung 16
Inhaltsverzeichnis
3 MATERIAL UND METHODIK 18
3.1 Inkubationsmedien und Zellkulturmaterial 18
3.2 Pharmaka und Agenzien 20
33 Kommerzielle Assay Systeme (cGMP, 6-keto-Prostaglandin Fla) 23
3.4 Geräte 23
3.5 Herkunft der bakteriellen Toxine 24
3.6 Human Umbilical Vein Endothelial Cells - (HUVEC) 24
3.6.1 Präparation der Endothelzellen 24
3.6.2 „Splitten der Endothelzellen 25
3.6.3 Identifizierung der Endothelzellen 25
3.7 Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) 26
3.8 RFL-6-Zellen (rat fetal lung fibroblasts) 27
3.9 Messung des Diacylglycerols 28
3.9.1 Markierung des Diacylglycerols 28
3.9.2 Dünnschicht-chromatographische Trennung der Phosphatidsäure 28
3.10 Messung der Inositolphosphate 29
3.10.1 Versuchsablauf und Extraktion der Inositolphosphate 29
3.10.2 Anionenaustausch-Chromatographie 30
3.11 Analytik des Plättchen-aktivierenden Faktors 32
3.11.1 Extraktion der Phospholipide 32
3.11.2 HPLC-Trennung der Phospholipidklassen 33
3.11.3 PAF-Bioassay 34
3.11.4 Methodik der Bioinkorporation-3 [H]-Acetat-Markierung 35
Inhaltsverzeichnis
3.12 Stickstoffmonoxid (NO)-Bioassay 37
3.12.1 NO-Donatoren 39
3.13 6-keto-Prostaglandin F|„ Assay-System 41
3.14 Lactatdehydrogenase-(LDH)-Messung 42
3.15 Bestimmung der Aktivität des E. coli Hämolysin (Hly A) 42
3.15.1 Hämolysin-Test 42
3.15.2 „Aging -Test . 43
3.16 Experimentelles Protokoll 44
3.17 Statistische Auswertung der dargestellten Ergebnisse 44
Inhaltsverzeichnis
4 ERGEBNISSE 45
4.1 Übersicht 45
4.2 Freisetzung vasoaktiver Mediatoren aus Endothelzellen
unter Exotoxineinwirkung 47
4.2.1 Plättchen-aktivierender Faktor (PAF) 47
4.2.2 Stickstoffmonoxid (NO) 51
4.2.3 PGI2-Freisetzung 56
4.3 Aktivierung endothelialer Signal-Transduktionswege
unter Exotoxineinwirkung 62
4.3.1 Inositolphosphat-Metabolismus in Endothelzellen unter
Exotoxineinwirkung 62
4.3.2 Messung des Diacylglycerols in Endothelzellen unter
Exotoxineinwirkung 67
4.4 Phannakologische Interventionsversuche 70
4.4.1 PAF-Rezeptorantagonist WEB 2086 70
4.4.2 Einfluß von Pertussis-Toxin (PT) auf die Toxin-induzierte
Signaltransduktion und Mediatorenfreisetzung 72
4.5 Kontrollexperimente 75
4.5.1 Aging-Experimente 75
4.5.2 Inkubation mit LPS 75
4.5.3 Zytotoxizitätsmessung mittels LDH-Freisetzung 76
Inhaltsverzeichnis
5 DISKUSSION 77
5.1 Die Rolle des Endothels in der Sepsis 77
5.2 Vergleich mikro- und makrovaskulärer humaner Endothelzellen
mit Endothelzellen vom Schwein 79
53 Diskussion des Mechanismus der Zellaktivierung durch
Staphylococcus aureus a-Toxin 80
5.4 Diskussion des Mechanismus der Zellaktivierung durch
Escherichia coli Hämolysin (HlyA) 81
5.5 Die postulierte Rolle der LPS 85
5.6 Die pathogenetische Relevanz bakterieller Exotoxine 86
6 ZUSAMMENFASSUNG 88
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