Untersuchung über die pflanzliche Acetyl-CoA-Synthetase (E C.6.2.1.1.) und Inhibition der de novo Fettsäurebiosynthese in Plastiden:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1993
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UNTERSUCHUNG UEBER DIE PFLANZLICHE ACETYL-COA
SYNTHETASE [E C.6.2.1.1.] UND INHIBITION DER DE NOVO
FETTSAEUREBIOSYNTHESE IN PIASTIDEN
ZUR ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN GRADES EINES
DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN
AN DER FAKULTAET FUER BIO- UND GEOWISSENSCHAFTEN
DER
UNIVERSITAET KARLSRUHE (TH)
VORGELEGTE
DISSERTATION
ANDREA GOLZ GEB. FELD
AUS
KARLSRUHE
1993
TAG DER MUENDLICHEN PRUEFUNG: 7. JULI 1993
REFERENT: PROF. DR. H. K. LICHTENTHALER
KORREFERENT: PROF. DR. J. RETEY
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN V
SUMMARV . VII
1. EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG. 1
1.1. HERBIZDDE UND PFLANZENPHYSIOLOGIE 1
1.2. UEBERBLICK UEBER DIE DE NOVO FETTSAEUREBIOSYNTHESE 3
1.3. DIE ACETYL-COA SYNTHETASE (ACS) 7
1.4. DER KNOBLAUCHWIRKSTOFF ALLICIN 8
1.5. PROBLEMSTELLUNG 10
2. MATERIAL UND METHODEN 13
2.1. BIOCHEMISCHE METHODEN 13
2.1.1. PFLANZENANZUCHT 13
2.1.1.1. JTOP/IAWITT-KEIMLINGE ZUR ACS-ISOLATION 13
2.1.1.2. STANDARDANZUCHT AUF TORF. 13
2.1.1.3. ALGENANZUCHT 14
2.1.2. ROHENZYMPRAEPARATION PFLANZLICHER ACS 14
2.1.2.1. STANDARDMETHODE MIT PLASTIDENISOLATION 14
2.1.2.2. ROHENZYMPRAEPARATION OHNE PLASTIDENISOLATION 16
2.1.2.3.ROHENZYMPRAEPARATION VON ACS AUS RATTENLEBER 16 2.1.3.
WEITERGEHENDE ACS-REINIGUNG AUS /JAPAANUS-KEINILINGEN 16 2.1.3.1.
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 17
2.1.3.2. FARBLIGAND-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 17
2.1.3.3. GELFILTRATION 18
2.1.4. ISOLATION VON INTAKTEN PIASTIDEN 18
2.1.5. PRAEPARATION EINER ENZYMFRAKTION MIT ACS-, ACC- UND
FAS-AKTIVITAET... 19 2.1.6. MESSUNG DER ACS-AKTIVITAET 19
2.1.7. MESSUNG DES EINBAUS RADIOAKTIVER SUBSTRATE IN FREIE FETTSAEUREN 21
2.1.7.1. DAS PLASTIDEN-TESTSYSTEM 21
2.1.7.2. MESSUNG DER FAS-AKTIVITAET 22
2.1.8. PROTEINBESTIMMUNG 23
2.1.9. CHLOROPHYLL- UND CAROTINOIDBESTIMMUNG 24
2.2. CHEMISCHE UND ANALYTISCHE METHODEN 24
2.2.1. ALLICIN 24
2.2.1.1. REINIGUNG VON KAEUFLICHEM ALLICIN 24
2.2.1.2. ISOLATION VON ALLICIN UND ALLIIN AUS ALLIUM SATIVUM L 25
2.2.1.3. SYNTHESE VON ALLICIN DURCH OXIDATION VON DIALLYLDISULFID 25
2.2.1.4. ALLICIN AUS SYNTHETISIERTEM ALLIIN 26
2.2.1.5. QUANTITATIVE BESTIMMUNG DES ALLICINGEHALTS 28 2.2.1.6.
HPLC-TRENNSYSTEM FUER ALLICIN 28
IMAGE 3
2.2.2. SYNTHESE VON DINOBEN 29
2.2.3. SYNTHESE VON ALKYLADENYLATEN ; .30
2.2.4. SYNTHESE VON ACETYLADENYLAT 31
2.2.5. HPLC-TRENNSYSTEM FUER ALKYLADENYLATE 31
2.2.6. HPLC-TRENNSYSTEM FUER COA-ESTER 32
2.2.7. FEHLERBETRACHTUNGEN 32
2.2.8. BERECHNUNGSGRUNDLAGEN ZUR AUSWEITUNG DER ERGEBNISSE 33
ERGEBNISSE
*********** ***** *.****************-********»******»*********************************»*******3T
3.1. REINIGUNG DER PFLANZLICHEN ACETYL-COA SYNTHETASE (ACS) 37 3.1.1.
OPTIMIERUNG DES ENZYMTESTS FUER DIE ACS 37
3.1.2. ROHENZYMFRAKTIONEN MIT ACS-AKTIVITAET IM VERGLEICH 41 3.1.3.
WEITERGEHENDE REINIGUNG DER PFLANZLICHEN ACS 44
3.1.3.1. EINFLUSS VON PUFFERBESTANDTEILEN AUF DIE ACS 44
3.1.3.2. FPLC-ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 46
3.1.3.3. FARBLIGANDAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE (MERCK-ORANGE) 47 3.1.3.4.
GELFILTRATION 49
3.1.3.5. REINIGUNGSTABELLE UND GELELEKTROPHORESE 49
3.1.3.6. ANSAETZE ZUR WEITERGEHENDEN REINIGUNG 51
3.2. EIGENSCHAFTEN DER PFLANZLICHEN ACETYL-COA SYNTHETASE (ACS) 53
3.2.1. LAGERSTABILITAET DER ACS 53
3.2.2. PH-OPTIMUM DER PFLANZLICHEN ACS AUS RAPHANUS 53
3.2.3. ISOELEKTRISCHER PUNKT (PL-WERT) DER RAPHANUS-ACS 54
3.2.4. TEMPERATURABHAENGIGKEIT DER ACS-AKTIVITAET 55
3.2.5. SUBSTRATSPEZIFITAETDERACS. 57
3.2.6. MICHAELIS-MENTEN KONSTANTEN (KM-WERTE) FUER DIE SUBSTRATE DER
ACS....59 3.3. HEMMSTOFFE DER PFLANZLICHEN ACETYL-COA SYNTHETASE (ACS)
61 3.3.1. ALKYLADENYLATE 61
3.3.1.1.1 50 -WERTE DER ALKYLADENYLATE FUER ISOLIERTE ACS 62 3.3.1.2.
REVERSIBILITAET DER ACS-HEMMUNG DURCH ALKYLADENYLATE 63 3.3.1.3.
BESTIMMUNG DER HEMMKONSTANTEN (KJ UND KY) DER ACS 64 3.3.1.4.
ALKYLADENYLATE IM PLASTIDEN-TESTSYSTEM 72
3.3.2. ALLICIN ALS HEMMSTOFF DER PFLANZLICHEN ACETYL-COA SYNTHETASE
(ACS) ..76 3.3.2.1. REINIGUNG VON ALLICIN (FA. ROTH) 76
3.3.2.2. QUANTITATIVE BESTIMMUNG DES ALLICINGEHALTES 85 3.3.2.3.
HEMMWIRKUNG VON ALLICIN 87
3.3.3. UNTERSUCHUNGEN UEBER WEITERE MOEGLICHE ACS-INHIBITOREN 94 3.4.
HEMMSTOFFE DER PFLANZLICHEN DE NOVO FETTSAEUREBIOSYNTHESE 96 3.4.1.
HEMMUNG DES PLASTIDAEREN PYRUVATDEHYDROGENASEKOMPLEXES 96
3.4.2. WIRKUNG DER ANTIBIOTIKA CERULENIN UND THIOLACTOMYCIN AUF DIE
FETTSAEUREBIOSYNTHESE 101
3.4.3. USNINSAEURE ALS POTENTIELLER INHIBITOR DER FAS 106
IMAGE 4
III
4. DISKUSSION 109
4.1. DIE PFLANZLICHE ACETYL-COA SYNTHETASE (ACS) 109
4.1.1. ENZYMREINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG 109
4.1.2. ALKYLADENYLATE ALS HEMMSTOFFE DER ACS 118
4.1.3. ALLICINWIRKUNGEN 125
4.2. HEMMUNG DES PLASTIDAEREN PYRUVATDEHYDROGENASEKOMPLEXES 131 4.3.
HEMMSTOFFE DER FETTSAEUREBIOSYNTHESE IM PLASTIDEN-TESTSYSTEM 137 4.3.1.
ANTIBIOTIKA CERULENIN UND THIOLACTOMYCIN 137
4.3.2. USNINSAEURE 140
ZUSAMMENFASSUNG 143
LITERATUR 149
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