Versuche zur Transformation von Chloroplasten bei Chlorella saccharophila 211-1a:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Aachen
Shaker
1992
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| Ausgabe: | Als Ms. gedr. |
| Schriftenreihe: | Reihe Biologie
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| Beschreibung: | 112 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1. GINLEITUNG 1
1.1. STRUKTUR DER CHLOROPLASTEN-DNA 2
1.2. DIE CHLOROPLASTEN-GENE 3
1.3. TRANSFORMATION VON CHLOROPLASTEN 7
1.4. ENTWICKLUNG EINES MARKERSYSTEMS ZUR TRANSFORMATION 9
VON CHLOROPLASTEN BEI CHLORELLA SACCHAROPHILA 211-1 A
2. MATERIAL 14
2.1. PFLANZENMATERIAL 14
2.2. BAKTERIENSTAEMME 14
2.3. BAKTERIOPHAGEN 14
2.4. PLASMIDE 14
2.5. SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE IS
2.6. CHEMIKALIEN 15
2.7. MEDIEN 15
2.7.1. BAKTERIENMEDIEN 15
2.7.2. ALGENMEDIEN 17
3. METHODEN 18
3.1. KULTIVIERUNG VON CHLORELLA SACCHAROPHILA 18
3.1.2. BESTIMMUNG DES ZELLTITERS 18
3.1.3. PROTOPLASTIERUNG 18
3.1.4. STREPTOMYCINSENSITIVITAETSTESTS 19
3.1.4.1. STREPTOMYCINSENSITIVITAETSTEST IN FLUESSIGKULTUR 19
3.1.4.2. STREPTOMYCINSENSITIVITAETSTEST AUF FESTMEDIUM 20
3.1.5. TRANSFORMATION VON CHLOROPLASTEN 20
3.1.5.1. MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG VON MIKROPROJEKTILEN UND 21
PLASMID-DNA INNERHALB DER ZELLEN
3.1.6. SELEKTION 22
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3.2. ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON DNA
.
2
2
3.2.1. PHENOLEXTRAKTION 22
3.2.2. ETHANOLFALLUNG 22
3.2.3. SCHNELLPRAEPARATION VON PLASMID- UND ML 3-RF-DNA 23
AUS G.COLI
3.2.4. GROSSPRAEPARATION VON PLASMID-UND ML3-RFI-DNA 24
AUS E. COLI
3.2.5. PRAEPARATION VON EINZELSTRAENGIGER M13-DNA AUS E. COLI 24
3.2.6. ISOLIERUNG VON GESAMT-DNA AUS CHLORELLA SACCHAROPHILA 25
3.2.7. ISOLIERUNG VON DNA AUS INTAKTEN CHLOROPLASTEN 26
3.2.8. REINIGUNG VON SYNTHETISCHEN OLIGONUKLEOTIDEN 27
3.2.9. BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION IN WAESSRIGER LOESUNG 29
3.3. ENZYMATISCHE METHODEN REKOMBINANTER DNA-TECHNOLOGIE 29
3.3.1. SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 29
3.3.2. PHOSPHATASE-REAKTION 30
3.3.3. PHOSPHORYLIERUNG VON FREIEN 5'-ENDEN 30
3.3.4. ENTFERNUNG VON EINZELSTRAENGIGEN 3'-ENDEN DURCH 31
SL-NUKLEASE
3.3.5. DNA-LIGATION 31
3.3.6. AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN (PCR) 32
3.3.7. SEQUENZIERUNG VON DOPPELSTRAENGIGER DNA 33
3.4. GELELEKTROPHORESE 34
3.4.1. AGAROSEGELELEKTROPHORESE 34
3.4.2. ELEKTROPHORESE IN ALTERNIERENDEN ELEKTRISCHEN FELDERN 35
3.4.3. POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 36
3.4.3.1. AUFTRENNUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN 36
3.4.3.2. SEQUENZIERGELE 37
3.4.4. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 38
3.5. DNA-KLONIERUNG IN E.COLI 39
3.5.1. PRAEPARATION KOMPETENTER ZELLEN 39
3.5.2. TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN ZELLEN 40
3.5.3.
3.5.4.
HERSTELLEN EINER CHLOROPLASTEN-DNA-BANK DURCH 40
"SHOTGUN CLONING"
GEZIELTE MUTAGENESE DURCH SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE 41
3.6. IDENTIFIZIERUNG VON SPEZIELLEN KLONEN DURCH SOUTHEM
HYBRIDISIERUNG 43
3.6.1. SOUTHERN-TRANSFER 43
3.6.2. HYBRIDISIERUNG MIT 32P.
M
ARKIERTEN DNA-PROBEN 44
3.6.3. DNA-NACHWEIS MITTELS CHEMIELUMINISZENZ 45
4. ERGEBNISSE 48
4.1. ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER CHLOROPLASTEN
DNA VON CHLORELLA SACCHAROPHILA 48
4.1.1. AUFTRENNUNG DER GESAMT-DNA DURCH CHEF-ELEKTRO
PHORESE UND IDENTIFIZIERUNG DER CHLOROPLASTEN-DNA 48
4.1.2. AUFTRENNUNG DER GESAMT-DNA DURCH CSCI-DICHTE
GRADIENTENZENTRIFUGATION 51
4.1.3. AUFREINIGUNG DER CHLOROPLASTEN-DNA AUS ISOLIERTEN
ORGANELLEN DURCH CSCI-DICHTEGRADIENTENZENTRIFIIGATION 52
4.1.3.1. IDENTIFIZIERUNG DER CHLOROPLASTEN-DNA 56
4.1.3.2. RESTRIKTION UND GROESSENBESTIMMUNG DER 57
CHLOROPLASTEN-DNA
4.2. KONSTRUKTION EINES VEKTORS ZUR TRANFORMATION VON 58
CHLOROPLASTEN
4.2.1. HERSTELLUNG EINES SELEKTIONSMARKERS 58
4.2.1.1. STREPTOMYCINSENSITIVITAET VON CHLORELLA SACCHAROPHILA 58
4.2.1.2. IDENTIFIZIERUNG EINES 16S RRNA-GENS VON 60
CHLORELLA SACCHAROPHILA
4.2.1.3. UMKLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES 16S RRNA-GENS 63
4.2.1.4. DESIGN DER MUTAGENEN OLIGONUKLEOTIDE 63
4.2.1.5. EINFUHREN EINES DEFINIERTEN BASENAUSTAUSCHES IN DAS 64
I6S RRNA-GEN
4.2.1.6. ZURUECKSETZEN DES MUTAGENISIERTEN FRAGMENTS IN DAS
16S RRNA-GEN 65
4.2.2. EINFUHREN EINES MARKERS ZUR RESTRIKTIONSANALYSE 66
4.3. TRANSFORMATION VON CHLOROPLASTEN BEI CHLORELLA 66
SACCHAROPHILA
4.4. SELEKTION STREPTOMYCINRESISTENTER KLONE 69
4.5. ANALYSE DER CHLOROPLASTEN-DNA STREPTOMYCINRESISTENTER 70
KLONE
4.5.1. RESTRIKTIONSANALYSE VON PCR-PRODUKTEN 70
4.5.2. HERSTELLUNG EINER REPRAESENTATIVEN GENOMISCHEN BANK 72
VON CHLORELLA SACCHAROPHILA CHLOROPLASTEN-DNA
4.5.3. IDENTIFIZIERUNG DER 16S RRNA-GENE AUS DER GENBANK 74
DES STREPTOMYCINRESISTENTEN KLONS KL 2
4.5.4. RESTRIKTIONS-UND SEQUENZANALYSE DER 16S RRNA-GENE 76
5. DISKUSSION 81
5.1. DARSTELLUNG DER CHLOROPLASTEN-DNA DURCH
CHEF-ELEKTROPHORESE 81
5.2. CHARAKTERISIERUNG DER CHLOROPLASTEN-DNA NACH
CSCL-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 83
5.3. CHLOROPLASTENKODIERTE STREPTOMYCINRESISTENZ 84
5.4. TRANSFORMATION UND SELEKTION 85
5.5. ANALYSE RESISTENTER KLONE 91
5.6. AUSBLICK 92
6. ZUSAMMENFASSUNG 94
7. ANHANG 96
8. LITERATUR 101 |
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