Partikel-Gel-Immunoassay zum Nachweis thrombozytärer Antigene und Antikörper:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
Mensch & Buch Verl.
2004
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| adam_text | I.Einleitung 1
2. Einführung in das Thema 1
2.1. Thrombozytenphysiologie 1
2.2. Struktur und Funktion der Thrombozyten-Glykoproteine 2
2.2.1. Glykoproteine: 2
2.2.2. Glykoproteinkomplexe (Autoantigene): 2
2.2.2.1. GPIIb/llla 2
2.2.2.2. GPIb/IX 3
2.2.2.3. GPIa/lla 4
2.2.3. Alloantigene 5
2.3. Immunthrombozytopenie 7
2.3.1. Autoimmunthrombozytopenie AITP 7
2.3.2. Alloimmunthrombozytopenie (NAITP) 9
2.3.3. Posttransfusionelle Purpura (PTP) 9
2.3.4. Passive Alloimmunthrombozytopenie (PAT) 10
2.3.5. Refraktärität gegen Thrombozytentransfusionen (PTR) 10
2.3.6. Transplantationsassozierte Alloimmunthrombozytopenie (TAT) 10
2.4. Medikamentös induzierte Immunthrombozytopenie 10
2.5. Nachweismethoden für anti-thrombozytäre Antikörper 11
2.5.1. Nachweisverfahren von Plättchen-assozierten IgG (Pa IgG) 12
2.5.1.1. Gesamt-Pa IgG-Tests 12
2.5.1.2. Oberflächen-Pa IgG 12
2.5.2. Glykoprotein-spezifische Nachweismethoden 14
2.5.2.1. Immunoblot Assays 14
2.5.2.2. Immunopräzipitation 14
2.5.2.3. Glykoprotein-Immobilisations-Assays 15
2.5.3. Partikel-Gel-Immunoassay 16
3. Zielsetzung der Arbeit 17
4. Material und Methoden 18
4.1. Materialien 18
4.1.1. Verwendete Pufferund Lösungen 18
4.1.2. Partikelpuffer 20
4.1.3. Avidin-FITC 20
4.1.4. Verwendete Partikel 21
4.1.5. Antikörper 21
4.1.6. Arzneistoffe 23
4.1.7. Arzneistoffmetaboliten 23
4.1.8. Testthrombozyten 23
4.1.9. Seren 24
4.1.10. Gelkarten 25
4.1.11. Kapillaren 26
4.1.12. Durchflusszytometrie (FACS) 26
4.2. Methoden 27
4.2.1. Gewinnung und Aufbewahrung der Seren 27
4.2.2. Präparation der Testthrombozyten 27
4.2.3. Biotinylierung der monoklonalen glykoproteinspezifischen Antikörper 27
4.2.3.1. Berechung des molaren Überschusses an Biotin 28
4.2.3.2. Bestimmung des Biotinylierungsgrades 30
4.2.4. Qualitätskontrolle der Streptavidin Partikel 32
4.2.5. Qualitätskontrolle der kovalent gecoateten Partikel 32
4.2.6. Alexa-Flour-488-Konjugation von Antikörpern 32
4.2.7. Antikörper-Kopplung an M270 Carboxyl-Dynal-Partikel: 32
4.2.8. MAIPA-Assay 34
4.2.8.1. Nachweis von Arzneistoff-bzw. Metabolit-abhängigen Antikörpern 36
4.2.9. Partikel-Gel-Immunoassay 36
4.2.9.1. Ziege-Antimaus-Partikel 36
4.2.9.2. Streptavidin-Biotin-Kopplung 37
4.2.9.3. Antikörper-beschichtete Partikel 39
4.2.9.4. Beurteilung der Partikel-Agglutination (semiquantitativer Score) 41
4.2.9.5. Untersuchung von Seren gesunder Spender 42
4.2.10. Durchflusszytometrie 42
4.2.10.1. Fluoreszenzpartikel-Immunoassay mit Streptavidin-Partikeln 43
4.2.10.2. Fluoreszenzpartikel-Immunoassay der Antikörper-beschichteten Partikel
mit Hilfe von PAP-Alexa-Komplexen 44
4.2.10.3. Fluoreszenzpartikel-Immunoassay mit Ziege-Antimaus-Partikeln 44
4.2.11. Glaskapillarmethode zum Nachweis von antithrombozytären Allo-, Auto- und
Medikamenten-bzw. Metabolit-abhängigen Antikörpern 46
5. Ergebnisse 48
5.1. PaGIA in der Gelkarte 48
5.1.1. GAM-Partikel 48
5.1.2. Streptavidin-Biotin-Kopplung 48
5.1.2.1. Qualitätskontrolle der Streptavidin Partikel 48
5.1.2.2. Seruminkubation nach Immobilisation der Glykoproteine 49
5.1.2.3. Untersuchung von Seren mit thrombozytenreaktiven Antikörpern 50
5.1.2.4. Untersuchung der Nachweisgrenze der Streptavidin-Biotin-Methode im
Vergleich zum MAIPA 52
5.1.2.5. Direkter PaGIA 53
5.1.2.6. Kurze Beurteilung der Biotin-Streptavidin-Kopplung 54
5.1.3. Antikörper-beschichtete Partikel 54
5.1.3.1. Untersuchung von thrombozytenreaktiven Alloantikörpern gegen HPA-1a... 54
5.1.3.2. Untersuchung von thrombozytenreaktiven Alloantikörpern gegen HPA-5b... 55
5.1.3.3. Untersuchung von thrombozytenreaktiven Autoantikörpern 55
5.1.3.4. Einfluss der verschiedenen monoklonalen Antikörper 55
5.1.3.5. Direkter PaGIA 56
5.1.3.6. Kurze Beurteilung der direkten Kopplung 57
5.2. Durchflusszytometrie 58
5.2.1. Streptavidin-Partikel 58
5.2.1.1. Untersuchung von thrombozytenreaktiven Alloantikörpern gegen HPA-1a... 58
5.2.1.2. Untersuchung von thrombozytenreaktiven Alloantikörpern gegen HPA-5b... 58
5.2.1.3. Untersuchung von thrombozytenreaktiven Autoantikörpern 58
5.2.1.4. Weitere Untersuchung von thrombozytenreaktiven Alloantikörpern gegen
HPA-5b 58
5.2.1.5. Kurze Beurteilung des durchflusszytometrischen Nachweises
thrombozytenreaktiver Antikörper mit Streptavidin-Partikeln 59
5.2.2. Antikörper-beschichtete Partikel und PAP-Alexa Verstärkung 59
5.2.2.1. Untersuchung von thrombozytenreaktiven Alloantikörpern gegen HPA-1a... 59
5.2.2.2. Untersuchung von thrombozytenreaktiven Alloantikörpern gegen HPA-5b... 59
5.2.2.3. Untersuchung von thrombozytenreaktiven Autoantikörpern 59
5.2.2.4. Vergleich des Nachweises thrombozytenreaktiver Antikörper mit FITC
markierten Antihuman-Antikörper bzw. mit PAP-Alexa 60
5.2.2.5. Kurze Beurteilung des durchflusszytoemtrischen Nachweises
thrombozytenreaktiver Antikörper mit antikörperbeschichteten Partikeln und
PAP-Alexa 61
5.3. Kapillaragglutinationstechnik 62
5.4. Untersuchung von Medikament-abhängigen Antikörpern mit der Kapillar-
agglutinationstechnik und mit FACS 63
5.4.1. Untersuchung von Metabolit-abhängigen Antikörpern 63
6. Diskussion 66
6.1. Ziege-Antimaus-Partikel 67
6.2. Streptavidin- Partikel (direkter- und indirekter PaGIA) 68
6.3. Antikörper-beschichtete Partikel (direkter- und indirekter-PaGIA) 70
6.4. Fluoreszenzpartikel-Immunoassay in der Durchflusszytometrie: 71
6.4.1. Nachweis thrombozytenreaktiver Antikörper mit Streptavidin-Partikeln 71
6.4.2. Nachweis thrombozytenreaktiver Antikörper mit Antikörper-beschichteten Partikeln
mit Hilfe von PAP-Alexa-Komplexen 71
6.5. Beurteilung des PaGIA zum Nachweis thrombozytenreaktiver Antikörper 72
7. Zusammenfassung 73
8. Literaturverzeichnis 74
9. Danksagung 79
10. Eidesstattliche Erklärung 80
11. Anlage 81
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