Untersuchungen zur transkriptionellen Regulation von vegf-A und vegf-D in humanen Magenkarzinomzellen:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
Mensch & Buch Verl.
2003
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| Schriftenreihe: | Forschungsberichte aus den Naturwissenschaften / Biologie
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 1
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis 3
1. Zusammenfassung 4
1. Summary 5
2. Einleitung 6
2.1. Das Magenkarzinom 6
2.2. Die Bedeutung von Angiogenese und Lymphangiogenese für die Tumormetastasierung 6
2.2.1. Angiogenese und hämatogene Metastasienjng 7
2.2.2. Lymphangiogenese und lymphogene Metastasierung 8
2.2.3. Die Familie der VEGF-Faktoren und ihre Rezeptoren 9
2.2.3.1. Struktur und biologische Eigenschaften von VEGF-A 11
2.2.3.2. Struktur und biologische Eigenschaften von VEGF-D 12
2.2.3.3. Vermittlung der Effekte von VEGF-A und VEGF-D durch ihre Rezeptoren 14
2.2.4. VEGF-A und VEGF-D im Adenokarzinom des Magens 15
2.3. Transkriptionelle vegf-A und vegf-D Regulation 15
2.3.1. Allgemeine transkriptjonelle Mechanismen 15
2.3.2. Die 5 -flankierenden Bereiche der Gene vegf-A und vegf-D 17
2.4. Signaltransduktion 18
2.5. Oxidativer Stress 20
3. Zielsetzung 24
4. Material und Methoden 25
4.1. Zellkultur 25
4.2. Transiente Transfektion und Stimulation von Reportergenkonstrukten 25
4.2.1. Transfektion durch Kalziumphosphat-Präzipitation 29
4 2 2. Transfektion mit Effectene* 29
4.3. Gentechnische und molekularbiologische Methoden 29
4.3.1. Elektrophoretische Auftrennung von DNA und RNA 29
4.3.2. Semiquantitative Duplex-RT-PCR 30
4.3.3. Transformation von E. co//mit Plasmiden / Plasmidpraparationen 30
4.3.4. Klonierung von Promotorelementen in Reportergenvektoren 31
4.3.4.1. Klonierung des humanen vegf-D Promotors 31
4.3.4.2. Herstellung von 5 -Deletionskonstrukten 33
4.3.4.3. Herstellung von Promotormutanten 33
4.3.4.4. Subklonierung in ein heterologes Promotorsystem 33
4.4. Identifizierung DNA-bindender Proteine mittels EMSA 34
Inhaltsverzeichnis
4.4.1. Hybridisierung und radioaktive Markierung von Oligonukleotiden 34
4.4.2. Endmarkierung von Oligonukleotiden 36
4.4.3. Präparation von Kemextrakten 36
4.4.4. EMSA 36
4.5. Immunodetektion von Proteinen 37
4.5.1. Western Blot 37
4.5.1.1. Herstellung von Zelllysaten 37
4.5.1.2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 38
4.5.1.3. Western Blot Analyse und Immunodetektion 38
4.5.2. Immunfluoreszenz-Färbung 38
4.5.3. ELISA 39
5. Ergebnisse 40
5.1. Oxidativer Stress reguliert das vegf-A Gen in humanen Magenkarzinomzellen 40
5.1.1. Untersuchungen zur H2O2-abhängigen Produktion und Sekretion von VEGF-A 40
5.1.2. Stimulation des vegf-A Promotors durch oxidativen Stress 40
5.1.3. Sp1/Sp3-vermittelte vegf-A Promotor-Stimulation durch oxidativen Stress 43
5.1.4. Die Stimulation von vegf-A durch H2O2 über Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs 50
5.2. Basale Transkriptionsregulation von vegf-D in humanen Magenkarzinomzellen 53
5.2.1. Expression von vegf-D in Magenkarzinomzelllinien 53
5.2.2. Die Promotoraktivität von vegf-D in Magenkarzinomzelllinien 54
5.2.3. Identifizierung regulatorischer vegf-D Promotorbereiche 54
5.2.4. Regulation des vegf-D Promotors durch DR-Element-bindende Faktoren 56
6. Diskussion 65
6.1. Die Regulation des vegf-A Gens durch oxidativen Stress in humanen Magenkarzinomzellen.. 65
6.1.1. Die Rolle von Sp1 und Sp3fürdie vegf-A Aktivierung 66
6.1.2. Oxidativer Stress aktiviert die vegf-A Expression durch den ERK1/2 MAPK-Weg 72
6.2. Die basale Regulation des vegf-D Promotors in humanen Magenkarzinomzellen 74
6.2.1. Die Superfamilie der Nuklearen Rezeptoren 75
6.2.2. Beteiligung Nuklearer Rezeptoren an der vegf-D Regulation in Magenkarzinomzellen 77
6.2.3. HNF4 transaktiviert den humanen vegf-D Promotor in Magenkarzinomzellen 79
6.3. Transkriptionelle Regulation von Genen der vegf-Familie 83
6.4. Schlussfolgerung 84
7. Literatur 87
Danksagung 100
Eidesstattliche Erklärung 101
Lebenslauf 102
Publikationsliste 103
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