Untersuchungen zur spezifischen Genexpression in humanen Hepatomzellen: eine HBV Hybrid mit mRNA mit mitochondrialen Domänen ; Expression eines cytoplasmatischen Antigens als Folge der malignen Entartung
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Gertner
1989
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| Schriftenreihe: | Reihe Wissenschaft
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | VIII, 162 S. 34 Ill. u. graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
A ZUSAMMENFASSUNG 1
B EINLEITUNG 3
1. DIE GRUPPE DER HEPADNA VIREN 3
2. AUFBAU DES HEPATITIS B VIRUS 3
3. GENOMORGANISATION 4
4. INFEKTION DER ZELLEN UND REPLIKATION 6
5. EXPRESSION DES HBV GENOMS 8
6. VERLAUFSFORMEN EINER HEPATITIS B VIRUS
INFEKTION 9
7. STRUKTUR INTEGRIERTER HBV DNA IN PRIMAEREN LEBERZELLKARZINOMEN 11
8. MODELLE EINER HBV INDUZIERTEN KARZINOGENESE 12
8.1 INSERTIONELLE MUTAGENESE 13
8.2 DIREKTE ONKOGENESE 13
8.3 INDIREKTE ONKOGENESE 14
9. SPEZIFISCHE VERAENDERUNGEN IN DER
ANTIGCNEXPRCSSION EINER TUMORZELLE 16
10. PROBLEMSTELLUNG 17
C ERGEBNISSE 21
1. KLONIERUNG HBV SPEZIFISCHER MRNAS AUS
DER HUMANEN HEPATOMZEUINIE PLC/PRF/5 21
1.1 ERSTELLUNG EINER CDNA BANK 22
1.1.1 WAHL DES VEKTORS 22
1.1.2 STRATEGIE DER CDNA SYNTHESE UND
ERSTELLUNG DER CDNA BANK 22
1.2 ISOLIERUNG HBV SPEZIFISCHER CDNA KLONE 29
1.2.1 IDENTIFIZIERUNG HBV SEQUENZEN ENHALTENDER
CDNAS 29
1.2.2 REKLONIERUNG DER HBV SEQUENZEN ENHALTENDEN
CDNAS 29
13 CHARAKTERISIERUNG DER CDNAS 30
HTTP://D-NB.INFO/890920222
30
32
32
35
35
39
39
40
42
43
49
51
52
53
54
54
55
55
55
56
56
56
II
CHARAKTERISIERUNG VON PCAL-40 UND PCAL-41
CHARAKTERISIERUNG VON PCAL-36
RESTRIKTIONSKARTIERIMG VON PCAL-36
PCAL-36 ALS
SONDE FUER EINEN GENOMISCHEN
SOUTHERN BLOT
SEQUENZANALYSE VON PCAL-36
BESONDERHEITEN DER SEQUENZ VON PCAL-36
FLANKIERENDE ZELLULAERE SEQUENZEN AM
3 ENDE
VON PCAL-36
VIRALE SEQUENZEN
FLANKIERENDE ZELLULAERE SEQUENZEN AM 5 ENDE
VON PCAL-36
NACHWEIS DER AL-36 MRNA UND DER
GENOMISCHEN SEQUENZ
MOEGLICHE EXPRESSIONSSIGNALE FUER DIE
AL-36 MRNA
LESERAHMEN IN AL-36
UEBERPRUEFUNG DER TRANSLATIONSPRODUKTE DER
AL-36 MRNA IN VITRO
ZWISCHENZUSAMMENFASSUNG
IDENTIFIZIERUNG EINES TUMORASSOZIIERT EXPRIMIERTEN
ANTIGENS IN DER PLC/PRF/5 ZELLINIE
HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER GEGEN
PLC/PRF/5 ZELLEN
IDENTIFIZIERUNG EINES TUMORSPEZIFISCHEN ANTIGENS
MIT EINEM MONOKLONALEN ANTIKOERPER
BESTIMMUNG DES SUBTYPS DES
MONOKLONALEN ANTIKOERPERS
CHARAKTERISIERUNG DER EXPRESSION VON
PLC-43
EXPRESSION VON PLC-43 IN HUMANEN
HEPATOMZELLINIEN, HEPATOMEN UND NORMALEM
MENSCHLICHEN LEBERGEWEBE
EXPRESSION IN HUMANEN HEPATOMZELLINIEN
EXPRESSION VON PLC-43
UNTER
HBV-EINFLUSS
III
2.3.1.3 EXPRESSION VON PLC-43 IN PLC/PRF/5
ZELLEN NACH DIFFERENZIERUNG MIT RETINSAEURE 58
2.3.1.4 EXPRESSION IN SOLIDEN HCCS, PERITUMORGEWEBE
UND NORMALEM LEBERGEWEBE 60
23.1.5 EXPRESSION IN MURMELTIER ( WOODCHUCK )
HEPATOMEN UND LEBER 60
2.3.2 PLC-43 EXPRESSION IN HUMANEN MALIGNEN UND
NORMALEN ZELLINIEN UNTERSCHIEDLICHEN
URSPRUNGS 63
2.3.3 PLC-43 EXPRESSION IN PERIPHEREN
BLUTLYMPHOZYTEN 64
2.3.4 EXPRESSION IN MAEUSE- UND RATTEN
ZELLINIEN 67
23.5 ZUORDNUNG VON PLC-43 ZU EINER DER
KLASSEN TUMORSPEZIFISCHER ANTIGENE 69
2.4 LOKALISATION VON PLC-43 IN DER ZELLE 70
2.5 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG
VON PLC-43 71
2.5.1 UNTERSUCHUNG DER GLYKOSYLIERUNG 71
2.5.2 UNTERSUCHUNG DER PHOSPHORYLIERUNG 71
3. IMMUNOSCREENING DER LAMBDA GTLL CDNA BANK
MIT PLC-43 73
4. ISOLIERUNG VON PLC-43 74
4.1 ISOLIERUNG VON PLC-43
ZUM SEQUENZIEREN 75
42 SEQUENZIERUNG 77
5. ZWISCHENZUSAMMENFASSUNG 82
D DISKUSSION 83
1. EXPRESSION EINER HYBRID-HBV MRNA MIT
MITOCHONDRIAL-AEHNLICHEN SEQUENZEN 84
1.1 DIE AL-36 MRNA - EIN TRANSKRIPT DER GENOMISCHEN
HBV INTEGRATE AL10.5 ODER AL10.7 84
IV
1.2 MITOCHONDRIALE SEQUENZEN AM 5* ENDE
DER AL-36 MRNA 84
1.3 ENTSTEHUNG DES AL-36 GENS 85
1.4 MOEGLICHE PUNKTIONEN DER AL-36 MRNA 88
2. EXPRESSION EINES TUMORSPEZIFISCHEN, CYTOPLASMATISCHEN
ANTIGENS IN HEPATOZELLULAEREN KAMNOMEN
UND ANDEREN TUMOREN 89
2.1 TUMORSPEZIFISCHE ANTIGENE UND ZELLULAERE
ONKOGENE 90
2.2 EXPRESSION TUMORSPEZIFISCHER ANTIGENE
IN HEPATOMZELLEN 91
2.3 IDENTIFIZIERUNG EINES BISHER UNBEKANNTEN,
CYTOPLASMATISCHEN TUMORANTIGENS IN EINER
HUMANEN HEPATOMZELLINIE 92
2.4 PLC-43 EXPRESSION IN VERSCHIEDENEN
STADIEN DER MALIGNEN ENTARTUNG 93
2.5 PLC-43 ALS ZIEL DER TRANSAKTIVIERUNG
DURCH HBV? 95
Z6 MOEGLICHE FUNKTIONEN SPEZIFISCH
EXPRIMIERTER ELONGAUEONSFAKTOREN
IN TRANSFORMIERTEN ZELLEN 96
2.7 IST PLC-43 EIN ZELLULAERES
ONKOGENPRODUKT? 97
E MATERIAL UND METHODEN 99
1. MATERIAL 99
1.1 CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL 99
1.2 ENZYME 101
13 BIOLOGISCHES MATERIAL 102
1.3.1 ZELLINIEN 102
1.3.2 GEWEBE 104
133 BAKTERIENSTAEMME 104
13.4 PLASMIDE 105
13.5 PHAGEN 105
V
2. METHODEN 106
2.1 ALLGEMEIN BENOETIGTE PUFFER UND MEDIEN 106
2.2 ZELLKULTUR 107
2.2.1 TRANSFEKTION EUKARYOTISCHER ZELLEN 107
2.2.2 IN VIVO MARKIERUNG VON ZELLKULTUREN
MIT
32
P 107
2.2.3 ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG PERIPHERER
BLUTLYMPHOZYTEN 108
2.3 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER
GEGEN HEPATOMZELLEN 109
2.3.1 IMMUNISIERUNGSSCHEMA 109
2.3.2 PRAEPARATION VON MAKROPHAGEN ALS FUTTERZELLEN
FUER HYBRIDOMAZELLEN 109
2.3.3 FUSION VON MAUSMILZZELLEN UND
MAUSMYELOMZELLEN 110
2.3.4 SELEKTION ANTIKOERPERPRODUZIERENDER
HYBRIDOMAZELLEN 111
2.3.5 REKLONIERUNG VON HYBRIDOMZELLKLONEN 111
2.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 112
2.4.1 HERSTELLUNG VON PROTEINGESAMTZELLEXTRAKTEN 112
2.4.2 HERSTELLUNG VON CYTOPLASMATISCHEN
PROTEINEXTRAKTEN 112
2.4.3 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH
SCHAFFNER UND WEISSMANN 113
2.4.4 SDS POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 114
2.4.4.1 FAERBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN MIT COOMASSIE
BRILLIANT BLUE 115
2.4.4.2 SILBERFARBUNG VON PROTEINGELEN 115
2.4.5 AUFREINIGUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 116
2.4.5.1 ANREICHERUNG DER IMMUNGLOBULINE AUS
MEDIENUEBERSTAENDEN 116
2.4.5.2 REINIGUNG DER IMMUNGLOBULINE 116
2.5 IMMUNOLOGISCHE NACHWEISMETHODEN 117
2.5.1 WESTERN BLOT 117
VI
2.5.1.1 UEBERTRAGUNG DER PROTEINE AUF
NITROZELLULOSE 117
2.5.1.2 ANTIKOERPERREAKTION 117
2.5.2 ELISA 118
2.53 IMMUNFLUORESZENZ 119
2.5.3.1 VORBEREITUNG VON ZELLEN FUER DIE
IMMUNFLUORESZENZ 119
2.5.3.2 VORBEREITUNG VON GEWEBESCHNITTEN FUER DIE
IMMUNFLUORESZENZ 119
2.5.33 ANTIKOERPERREAKTION 120
2.5.4 IMMUNPEROXIDASEFAERBUNG VON ZELLEN
UND GEWEBESCHNITTEN 120
2.6 ANTIGENISOLIERUNG DURCH AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 120
2.6.1 KOPPLUNG VON IMMUNGLOBULINEN AN
CNBR-AKTIVIERTE SEPHAROSE CL 4B 121
2.6.1.1 ISOLIERUNG DES ANTIGENS MIT
SEPHAROSE CL4B-68 121
2.62 ISOLIERUNG DES ANTIGENS MIT
PROTEIN A SEPAHROSE CL 4B 122
2.6.2.1 ISOLIERUNG DURCH SAEULENCHROMATOGRAPHIE 122
2.6.2.2 ISOLIERUNG IM BATCH VERFAHREN 122
2.7 ISOLIERUNG VON RNA 123
2.7.1 ISOLIERUNG VON RNA AUS EUKAIYOTISCHEN
ZELLEN 123
2.7.2 ISOLIERUNG VON RNA AUS GEWEBE 123
2.7.3 ISOLIERUNG POLYADENYLIERTER RNA AUS
GESAMT-RNA 124
2.8 ELEKTROPHORESE VON RNA 125
2.9 TRANSFER VON RNA AUS AGAROSEGELEN AUF
NITROZELLULOSE ( NORTHERN BLOT ) 125
2.10 DNA-ISOLIERUNGEN 126
2.10.1 FAELLEN UND LOSEN VON NUKLEINSAEUREN 126
2.10.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 116
2.10.3 PRAEPARATION VON PLASMID DNA DURCH
ALKALISCHE LYSE 126
2.10.4 PLASMIDSCHNELLPRAEPARATION 127
VII
2.10.5 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA AUS
EUKARYOTISCHEN ZELLEN ODER GEWEBEN 127
2.10.6 PRAEPARATION VON DNA AUS ZELLKERNEN 128
2.10.7 PRAEPARATION VON PHAGEN DNA 129
2.10.8 PRAEPARATION VON PHAGEN DNA IM
KLEINEN MASSSTAB 129
2.11 ELEKTROPHORESE VON DNA 130
2.11.1 PRAEPARATIVE GELELEKTROPHORESE 130
2.11.1.1 ELEKTROELUUEON AUF
LONENAUSTAUSCHERPAPIER DE81 130
2.11.1.2 ELEKTROELUTION IN EINEN DIALYSESCHLAUCH 131
2.11.2 ALKALISCHE AGAROSEGELELEKTROPHORESE 131
2.12 TRANSFER VON DNA AUS AGAROSEGELEN AUF
NITROZELLULOSE ( SOUTHERN BLOT ) 131
2.13 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA 132
2.13.1 NICKTRANSLATION 132
2.13.2 MARKIERUNG DURCH RANDOM-PRIMER SYNTHESE 133
2.14 HYBRISIERUNG VON NITROZELLULOSEFILTERN
(SOUTHERN ODER NORTHERN BLOTS
UND PLAQUEHYBRIDISIERUNG) 133
2.15 RE- UND SUBKLONIERUNG VON DNA
FRAGMENTEN IN PLASMIDE 134
2.15.1 RESTRIKTION 134
2.15.2 DEPHOSPHORYLIERUNG 134
2.153 AUFFUELLEN VON 5 UEBERHAENGENDEN ENDEN 135
2.15.4 LIGATION 135
2.15.5 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN 135
2.15.6 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN
BAKTERIEN MIT PLASMIDEN 136
2.16 SEQUENZIERUNG VON DNA 136
2.16.1 PRAEPARATION DER PLASMID-DNA ZUM
SEQUENZIEREN 137
2.16.2 DENATURIERUNG UND HYBRIDISIERUNG
DES PRIMERS 137
2.16.3 SEQUENZIERREAKTION 138
2.16.4 SEQUENZGEL 139
2.17 SYNTHESE UND KLONIERUNG VON CDNA 139
VIII
2.17.1 OLIGO DT GEPRIMETE SYNTHESE DES 1. STRANGES 140
2.17.2 SYNTHESE DES ZWEITEN STRANGES 141
2.17.3 S1 NUKLEASE VERDAU DER HAARNADELSTRUKTUREN 142
2.17.4 METHYLIENMG VON ECORI SCHNITTSTELLEN 143
2.17.5 AUFFUELLEN UEBERHAENGENDER ENDEN MIT
DNA POLYMERASE I, KLENOW FRAGMENT 143
2.17.6 LIGATION VON ECORI LINKERN 143
2.17.7 ABTRENNUNG DER FREIEN LINKER VON DER CDNA 144
2.17.8 LIGATION MIT DEM VEKTOR LAMBDA GTLL 144
2.17.9 IN VITRO VERPACKUNG VON PHAGEN DNA
IN PHAGENKOEPFE 144
2.17.10 AUSPLATTIEREN VON PHAGEN AUF
INDIKATORBAKTERIEN 145
2.17.11 HERSTELLUNG VON LAMBDA GTLL PLATTENLYSATEN 145
2.17.12 HERSTELLUNG LYSOGENER, LAMBDA GTLL
HALTIGER BAKTERIEN 145
2.18 IDENTIFIZIERUNG SPEZIFISCHER CDNA KLONE 146
2.18.1 IDENTIFIZIERUNG VON CDNA KLONEN MIT
RADIOAKTIV MARKIERTEN DNA-SONDEN 146
2.18.2 SCREENING DER CDNA BANK MIT ANTIKOERPERN 146
2.19 IN VITRO EXPRESSION KLONIERTEN CDNA 147
2.19.1 IN VITRO TRANSKRIPTION 147
2.19.2 IN VITRO TRANSLATION 148
F LITERATUR 148
G ABKUERZUNGEN 160
H LEBENSLAUF 162
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