Identifizierung und Charakterisierung zellulärer 5-Lipoxygenase-Inhibitoren und -Aktivatoren in menschlichen Leukozyten:
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Veröffentlicht: |
Tübingen
1996
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adam_text | IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG ZELLULAERER
5-LIPOXYGENASE-INHIBITOREN UND -AKTIVATOREN IN MENSCHLICHEN LEUKOZYTEN
DISSERTATION DER FAKULTAET FUER CHEMIE UND PHARMAZIE DER
EBERHARD-KARLS-UNIVERSITAET TUEBINGEN ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES
DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN 1996 VORGELEGT VON OLIVER WERZ
INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 1 1.1 GESCHICHTLICHE
ENTWICKLUNG DER EIKOSANOIDFORSCHUNG 1 1.2 EIKOSANOIDE 2 1.3 DER
CYCLOOXYGENASESTOFFWECHSEL 4 1.4 DER LIPOXYGENASESTOFFWECHSEL 6 1.4.1
12-LIPOXYGENASE 6 1.4.2 15-LIPOXYGENASE 8 1.4.3 5-LIPOXYGCNASC 10 1.4.4
LTA 4 -HYDROLASE UND LTC 4 -SYNTHASE . 13 1.5 REGULATION DER
5-LIPOXYGENASEAKTIVITAET 15 1.6 PHYSIOLOGIE UND PATHOPHYSIOLOGIE DES
5-LIPOXYGENASESTOFFWECHSELS 22 1.6.1 LEUKOTRIENB, 22 1.6.2 LTC 4 , LTD,
UND LTE, 24 1.7 PHARMAKOLOGISCHE BEEINFLUSSUNG DER LEUKOTRIENPRODUKTION
26 1.8 SELEN UND SELENABHAENGIGE GLUTATHION-PEROXIDASEN 30 1.9
TRANSFORMING GROWTH FAKTOR-BETA 32 1.10 LCUKAEMIEZELLINIEN UND
EBV-TRANSFORMIERTE B-ZELLINIEN ZUR UNTERSUCHUNG DER
5-LIPOXYGENASEEXPRESSION UND -AKTIVITAET 35 1.10.1 HL60 ZELLEN 35 1.10.2
MONO MAC 6 ZELLEN 40 1.10.3 BL41-E95-A ZELLEN 41 1.11 ZIEL DER ARBEIT 42
11 2 MATERIAL UND GERAETE 44 2.1 MATERIAL 44 2.2 GERAETE 46 3 METHODEN 47
3.1 ZELLEN UND ZELLKULTUR 47 3.1.1 ZELLINIEN 47 3.1.2 ISOLIERUNG
MENSCHLICHER GRANULOZYTEN 48 3.1.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL UND
ZELLVITALITAET 49 3.2 5-LIPOXYGENASEASSAY 49 3.2.1 INTAKTE ZELLEN 49
3.2.2 ZELLHOMOGENATE 50 3.2.3 SUBZELLULAERE FRAKTIONEN 50 3.3
HPLC-ANALYSE DER 5-LO METABOLITE 50 3.4 BESTIMMUNG DER
GLUTATHION-PCROXIDASE AKTIVITAET 51 3.4.1 PROBENVORBEREITUNG 51 3.4.2
GLUTATHION-PEROXIDASEASSAY 52 3.5 ISOLIERUNG VON TGF-SS AUS MENSCHLICHEN
THROMBOZYTEN 52 3.5.1 GEWINNUNG DER THROMBOZYTEN 52 3.5.2 LYSE DER
THROMBOZYTEN UND GEWINNUNG DER PROTEINFRAKTION 53 3.5.3 AUFTRENNUNG DER
PROLEINFRAKTION MITTELS GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE 53 3.5.4
KATIONENAUSTAUSCH-HPLC 54 3.5.5 REVERSED-PHASE HPLC 55 3.5.6
QUANTIFIZIERUNG VON TGF-SS 55 3.6 SDS-PAGE 56 3.7 RNA EXTRAKTION 56 III
3.8 RT-PCR ANALYSE (STANDARDPROTOKOL!) 57 3.9 PARTIELLE ISOLIERUNG DER
5-LIPOXYGCNASE AUS GRANULOZYTEN UND VERSCHIEDENEN ZELLINIEN 58 3.10
PARTIELLE REINIGUNG DES 5-LIPOXYGENASE AKTIVIERENDEN FAKTORS (5-LAF) 59
3.10.1 ATP-AGAROSC AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE I..T.-Z 59 3.10.2
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE 59 3.10.3 ANIONENAUSTAUSCHCHROMALOGRAPHIE
MIT Q-SEPHAROSE FAST FLOW 60 3.10.4 KATIONCNAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE MIT
S-SEPHAROSE FAST FLOW 60. 3.10.5 ENTSALZEN DER FRAKTIONEN MITTELS PD-10
SAEULEN 60 3.11 GCLPCRMCATIONSCHROMATOGRAPHISCHE AUFTRENNUNG DER 100.000G
UEBERSTAENDE VON HL60 UND BL41-E95-A ZELLEN 61 4 ERGEBNISSE ,. ..,,,
.....62 4.1 ISOLIERUNG VON TRANSFORMING GROWTH FAKTOR-BETA AUS
THROMBOZYTEN 62 4.1.1 THROMBOZYTEN ALS QUELLE FUER TGF-SS 62 4.1.2
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE 63 4.1.3 KATIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
64 4.1.4 REVERSED-PHASC HPLC 66 4.1.5 ZUSAMMENFASSUNG 67 4.2
IDENTIFIZIERUNG .SELENABHAENGIGER GLUTALHION-PEROXIDASEN ALS HEMMENDES
PRINZIP DER 5-LIPOXYGENASEAKTIVITAET IN LCUKAEMIEZELLEN UND B-LYMPHOZYTEN
69 4.2.1 5-LIPOXYGENASEAKTIVITAET IN HL60 ZELLEN 69 4.2.1.1
DIFFERENZIERUNG IN FCS-MEDIUM 69 4.2.1.2 DIFFERENZIERUNG IN SERUMFREIEM
MEDIUM 71 4.2.2 5-LIPOXYGENASEAKTIVITAET IN BL4I-E95-A ZELLEN 73 4.2.3
5-LIPOXYGENASEAKTIVITAETEN IN MONO MAC 6 ZELLEN 75 IV 4.2.4 SELENZUGABE
ZU SERUNIFREIEM MEDIUM FUEHRT ZUR HEMMUNG DER ZELLULAEREN 5-LO AKTIVITAET
77 4.2.4.1 SELENEFFEKT AUF DIE 5-LO AKTIVITAET IN HL60 ZELLEN 77 4.2.4.2
SELENEFFEKT AUF DIE 5-LO AKTIVITAET IN BL41-E95-A ZELLEN 84 4.2.4.3
SCLCNEFFCKT AUF DIE 5-LO AKTIVITAET IN MONO MAC 6 ZELLEN 86 4.2.5 EFFEKTE
VON GLUTATHION UND DITHIOLHRCITOL AUF DIE 5-LO AKTIVITAET 88 4.2.5.1
ZUSAMMENHANG ZWISCHEN DER 5-LO HEMMUNG IN GSH- BZW. DTT-HALTIGEN
ZELLHOMOGENATEN UND DER ZELLULAEREN 5-LO AKTIVITAET IN HL60 ZELLEN 88
4.2.5.2 EFFEKTE VON DTT UND GSH IM 100.000G UEBERSTAND VON HL60 ZELLEN 91
4.2.5.3 VERGLEICH DER 5-LO AKTIVITAET THIOLHALTIGER HOMOGENATE VON HL60
ZELLEN UND GRANULOZYTEN 92 4.2.5.4 EFFEKT DER SELENKONZENTRATION IM
MEDIUM AUF DIE HEMMUNG DER 5-LO AKTIVITAET IN HOMOGENATEN VON HL60 ZELLEN
DURCH DTT UND GSH 93 4.2.5.5 EFFEKTE VON GLUTATHION UND DTT AUF DIE 5-LO
AKTIVITAET IN BL41-E95-A ZELLEN 98 4.2.5.6 PARTIELLE ISOLIERUNG DER
5-LIPOXYGENASE AUS BL41-E95-A ZELLEN 102 4.2.5.7 EFFEKTE VON THIOLEN AUF
DIE 5-LO AKTIVITAET IN HOMOGENATEN VON MONO MAC 6 ZELLEN 103 4.2.5.8
HEMMEFFEKTE DES 100.000G UEBERSTANDS UNDIFFERENZIERTER MONO MAC 6 ZELLEN
104 4.2.6 CHARAKTERISIERUNG DES SELENHEMMEFFEKTS 107 4.2.6.1 EFFEKTE VON
MERCAPTOSUCCINAT 107 4.2.6.2 EINFLUSS VON SULFOBROMOPHTHALEIN AUF DIE
AKTIVITAETSREGULATION DER 5-LO 110 4.2.6.3 EFFEKTE VON IODACCTAT 111
4.2.6.4 SPEZIFITAET DES SELENOENZYMS FUER DAS KOSUBSTRAT 114 4.2.6.5
ABSCHAETZUNG DER GROESSE DES SELENABHAENGIGEN INHIBITORS MITTELS
GELFILTRATION... 115 4.2.6.6 MESSUNG DER PEROXIDASEAKTIVITAET IN HL60,
BL41-E95-A UND MONO MAC 6 ZELLEN 118 4.2.6.7 BESTIMMUNG DER
MRNA-EXPRESSION DER GPX UND DER PHGPX IN HL60, MONO MAC 6 UND BL41-E95-A
ZELLEN 120 4.2.7 DISKUSSION 122 4.3 IDENTIFIZIERUNG UND
CHARAKTERISIERUNG DES TGF-SS/VD, INDUZIERTEN AKTIVICRUNGSMCCHANISMU.S IN
HL60 ZELLEN UND GRANULOZYTEN 135 4.3.1 IDENTIFIZIERUNG DES 5-LO
AKTIVIERENDEN PRINZIPS IM 100.000G UEBERSTAND VON GRANULOZYTEN 135 4.3.2
AUFTRENNUNG DES 100.000G UEBERSTANDS VON GRANULOZYTEN UEBER ATP-AGAROSE
138 4.3.3 NACHWEIS DER PEROXIDASEAKTIVITAET IM 100.000G UEBERSTAND VON
GRANULOZYTEN 141 4.3.4 UEBERPRUEFUNG DES 5-LO STABILISIERENDEN PRINZIPS
VON GRANULOZYTEN AM MODELL DES MM6-HCMMEFFEKTS 145 4.3.4.1 VERGLEICH DER
STABILITAET DER 5-LO AKTIVITAET DER 100.000G UEBERSTAENDE VON BL4I-E95-A
ZELLEN UND GRANULOZYTEN GEGEN EXOGENE PEROXIDASEAKTIVITAET
UNDIFFERENZIERTER MM6 ZELLEN 145 4.3.4.2 UEBERPRUEFUNG DER NACL-FRAKTION
AUF DIE ANWESENHEIT DES 5-LO AKTIVIERENDEN FAKTORS ANHAND DER
HEMMAKTIVITAET UNDIFFERENZIERTER MM6 ZELLEN 147 4.3.4.3 EINFLUSS DER
ATP-DURCHLAUFFRAKTION VON GRANULOZYTEN AUF DIE AKTIVILAETSREGULATION DER
5-LO GEGENUEBER DEM MM6-HEMMEFFEKT 149 4.3.4.4 AUFTRENNUNG DER
NACL-FRAKTION UEBER PD-10 SAEULEN 151 4.3.4.5 INAKTIVIERUNG DER
STABILISIERENDEN AKTIVITAET DER NACL-FRAKTION 152 4.3.5 DISKUSSION 154
4.4 REINIGUNG DES 5-LIPOXYGENASE AKTIVIERENDEN FAKTORS (5-LAF) 160 4.4.1
ATP-AGAROSE AFFINILAETSCHROMATOGRAPHIE 160 VI 4.4.1.1 KLAERUNG DES
BINDUNGSPRINZIPS DES 5-LO AKTIVIERENDEN FAKTORS AN DIE ATP-AGAROSE 160
4.4.2 GELFILTRATION DES 5-LO AKTIVIERENDEN FAKTORS 161 4.4.2.1
AUFTRENNUNG DER NACL-FRAKTION MITTELS GELFILTRATION 161 4.4.2.2
AUFTRENNUNG DES 100.000G UEBERSTANDS VON GRANULOZYTEN MITTELS
GELFILTRATION 164 4.4.3 IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHISCHE TRENNUNG DES
5-LO AKTIVIERENDEN FAKTORS.... 166 4.4.3.1 S-SEPHAROSE TRENNUNG DES
NACL-FAKTORS 166 4.4.3.2 Q-SEPHAROSE TRENNUNG DES NACL-FAKTORS 167 4.4.4
DISKUSSION 169 5 ZUSAMMENFASSUNG
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6 LITERATUR 173
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