Die DNA-Gyrase aus Clostridium acetobutylicum: molekularbiologische Charakterisierung und Einfluß auf die Genregulation
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1995
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Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungen VI
1. Einleitung 1
2. Material und Methoden S
2.1 Organismen und Plasmide 5
2.2 Zellanzucht 7
2.2.1 Nährmedien 7
2.2.1.1 LB-Medium 8
2.2.1.2 CBM-Medium 8
2.2.1.3 Milchmedium 8
2.2.1.4 Phosphatlimitiertes Minimalmedium für kontinuierliche Kulturen 9
2.2.1.5 2xYT-Medium 9
2.2.1.6 Medienzusätze 10
2.2.2 Stammhaltung und ReinheitskontroUe 10
2.2.3 Statische Kultur 11
2.2.4 Kontinuierliche Kultur 11
2.2.5 Bestimmung von Wachstumsparametem 12
2.2.5.1 Messung der optischen Dichte 12
2.2.5.2 Messung des pH-Werts 12
2.2.5.3 Bestimmung des Produktspektrums 12
2.3 Standardtechniken für das Arbeiten mit Nukleinsäuren 13
2.3.1 Behandlung von Geräten und Lösungen 13
2.3.2 Reinigung und Konzentrierung von Nukleinsäuren 14
2.3.2.1 Phenol-Chloroform-Extraktion 14
2.3.2.2 Fällung von Nukleinsäuren 14
2.3.2.3 Mikrodialyse von Nukleinsäuren 15
2.3.2.4 Konzentrationsbestimmung 15
2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese 15
2.3.3.1 Standard-Agarose-Gelelektrophorese 15
2.3.3.2 Denaturierende Agarose-Gelelektrophorese 16
2.3.3.3 Größenbestimmung von Nukleinsäuren 18
2.4 Isolierung von Nukleinsäuren 19
2.4.1 Plasrm d-Mini-PräparationausEco/i 19
2.4.2 Plasmid-Präparation aus K coli mittels Säulenchromatographie 20
2.4.3 Isolierung chromosomaler DNA aus C. acetobutylicum 22
2.4.4 Isolierung chromosomaler DNA aus B. subtilis 23
2.4.5 Isolierung von DNA-Fragmenten durch Adsorption an Glasmilch 25
2.4.6 Isolierung von Gesamt-RNA 26
2.5 Enzymatische Modifikationen von Nukleinsäuren 28
2.5.1 DNA-Restriktionsanalyse 28
2.5.2 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten 28
2.5.3 Herstellung von blunt-end -Fragmenten 29
2.5.4 Ligierung von DNA-Fragmenten 29
2.5.5 Amplifikaü on von DNA mittels PCR 30
2.6 Transformation 31
2.6.1 Transformation von £ coli durch Elektroporation 31
2.6.2 Transformation von C. acetobutylicum durch Elektroporation 31
2.6.3 Konjugation zwischen Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien 32
2.7 Übertragung von Nukleinsäuren auf Nylonmembranen 33
2.7.1 Southern-Blots 33
2.7.2 Northern-Blots 34
2.7.3 Dot-Blots 34
2.7.4 Herstellung von Filtern für die Koloniehybridisierung 34
2.8 Radioaktive Markierung von DNA 35
2.8.1 Radioaktive Endmarkierung von Oligonukleotiden 35
2.8.2 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten 36
2.9 Hybridisierung 36
2.9.1 Hybridisierung mit DNA-Fragmenten 36
2.9.2 Wiederverwendung von Nylonmembranen 37
2.10 Herstellung von synthetischen Oligonukleotiden 38
2.11 Herstellung einseitig verkürzter Subklone 38
2.12 Sequenzierung von DNA 39
2.12.1 Sequenzierung von Plasmid-DNA 39
2.12.2 Polyacrylamid-GelelektrophoresevonDNA 41
2.13 RNA-Analysen 42
2.13.1 Primer-Extension 43
; 2.13.2 Sl-Nuklease-Kartierung 44
2.14 Autoradiographie 45
2.15 Computeranalysen 46
2.16 Heterologe Überexpression plasmidkodierter Proteine in E. coli BL21(DE3) 46
2.17 Proteinanalysen 47
2.17.1 Herstellung von Rohextrakten 47
2.17.2 Affinitätschromatographie an immobilisieitem Nickel 47
2.17.3 Bestimmung von Proteinkonzentrationen 48
2.17.3.1 Methode nach Lowry 48
2.17.3.2 Methode nach Bradford 49
2.17.4 SDS-Polyacrylamid-Geklektrophorese 49
2.17.5 Größenstandard für Proteingele 51
2.17.6 Coomassie-Färbung 52
2.17.7 Silberfärbung 52
2.18 Lösungen und Puffer 54
2.19 Geräte, Chemikalien, Enzyme und Gase 54
3. Experimente and Ergebnisse 57
3.1 Klonkrung und Analyse des chromosomalen DNA-Bereichs
mit dem Gyraseoperon aus C. acetobutylicum DSM 792 57
3.1.1 Klonierung und Sequenzierung 57
3.1.2 Analyse der Sequenzdaten 64
3.1.3 Molekulargenetische Analyse des Gyraseoperons 68
3.1.4 Analysen zum Vergleich von Gyrasegenen verschiedener Organismen 70
3.2 Gezielte Mutagenese der Gyrasegene aus C. acetobutylicum DSM 792 73
3.2.1 Herstellung eines Plasmidkonstrukts 74
3.2.2 Transformation von C. acetobutylicum DSM 792 76
3.2.3 Untersuchungen des plasraidhaltigen Stamms C. acetobutylicum 2/2
in statischer Kultur 79
3.2.4 Untersuchungen des plasmidhaltigen Stamms C. acetobutylicum 2/2
in kontinuierlicher Kultur 82
3.2.5 Molekulargenetische Analysen des plasmidhaltigen Stamms
C. acetobutylicum 2/2 84
3.3 Spezifische Hemmung der Gyrase aus C. acetobutylicum DSM 792
durch Antibiotika 87
3.3.1 Bestimmung der Antibiotika-Resistenz im Reihenverdünnungstest 88
3.3.2 Entwicklung eines Testsystems zur Bestimmung von Promoteraktivitäten 88
3.3.3 Promoteraktivitäten von Enzymen des Gärungsstoffwechsels 92
3.3.4 Promoteraktivitäten von Proteinen der Hitzeschockantwort 95
3.4 Heterologe Überexpression der B-Untereinheit der Gyrase aus
C. acetobutylicum DSM 792 97
4. Diskussion 102
4.1 Das Gyraseopcron aus C. acetobutylicumDSM792 102
4.1.1 DieGyrase 102
4.1.2 DasrecF-Gen 107
4.1.3 DecorfX 108
1 4.1.4 DieOperonstruktur 109
4.1.5 Der Replikationsursprang des Chromosoms (on Q 110
4.1.6 Die Gyrasegene aus verschiedenen Organismen 111
4.2 Gezielte Mutagenese der Gyrasegene aus C. acetobutylicum DSM 792 112
4.2.1 DasPlasmidpSUO 115
4.2.2 Transformation von pSU 13 und molekulargenetische
Untersuchungen von C. acetobutylicum 2/2 117
4.3 Hemmung der Gyrase in vivo und Untersuchungen zu Promoteraktivitäten 124
4.4 Der Zusammenhang zwischen der Initiation der Lösungsmittelbildung,
Hitzeschockantwort und Sporulation in C. acetobutylicum 130
4.5 Ausblick 133
5. Anhang 135
5.1 Klonierung und Analyse des chromosomalen DNA-Bereichs mit dem
motA/B-Operon aus C. acetobutylicum DSM 792 135
5.2 Der Zusammenhang zwischen Motilität und Lösungsmittelbildung
in C. acetobutylicum 138
6. Zusammenfassung 141
7. Literatur 144
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