AMACO und Kollagen XXVIII, zwei extrazelluläre Matrixproteine mit VWA-ähnlichen Domänen:
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2007
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis V
1 Einleitung 1
1.1 Die extrazelluläre Matrix: Hochorganisierte Komplexe mit vielfältigen Funktionen....1
1.2 Domänen als Bausteine der Matrixproteine 1
1.2.1 Von Willebrand Faktor A-ähnliche Domänen (VWA) vermitteln Interaktionen 2
1.2.2 EGF-ähnliche Domäne, mehr als ein Abstandshalter 3
1.2.3 Kollagendomäne, Prototyp einer Matrixdomäne 5
1.3 Zwei neue Proteine mit VWA-ähnlichen Domänen 7
1.3.1 AMACO 7
1.3.2 Kollagen XXVIII 10
1.4 Der Zebrafisch als Modellorganismus 11
1.4.1 Kurzer Überblick über die Entwicklung eines Zebrafisches 12
1.4.2 MorphoYmo-Knockdown Technik 14
1.5 Zielsetzung der Arbeit 15
2 Ergebnisse 17
2.1 AMACO 17
2.1.1 Generierung der Konstrukte 17
2.1.2 Expressionsstudien 18
2.1.2.1 Expression in der Haut 19
2.1.2.1.1 AMACO ist mit der Basalmembran assoziiert 20
2.1.2.1.2 Elektronenmikroskopische Aufnahmen lokalisieren AMACO in der Sublamina
densa 21
2.1.2.2 Expression in der Niere 22
2.1.2.2.1 Räumliche Ablegung von AMACO in der Niere 23
2.1.3 Zelladhäsion 25
2.1.3.1 AMACO vermittelt Zelladhäsion 26
2.1.3.2 Kationenabhängigkeit der Zelladhäsion 27
2.1.3.3 Inhibition der Zelladhäsion durch RGD-Peptide und Antikörper 29
2.1.3.4 Zelladhäsion im Menschen 29
2.1.4 Glykosylierung 31
2.1.4.1 N-Glykosylierung und O-Glykosylierung 31
2.1.4.2 O-Glucosylierung und O-Fucosylierung 33
2.1.4.3 Die erste EGF-ähmliche Domäne enthält eine seltene Konsensussequenz für eine
O-Glucosylierung und O-Fucosylierung 33
I
Inhaltsverzeichnis
2.1.4.4 Die Konsensussequenzen sind glykosyliert 34
2.1.4.5 AMACO-P2 ist O-fucosyliert und O-glucosyliert 39
2.1.5 AMACO im Zebrafisch 41
2.1.5.1 Genstruktur 41
2.1.5.2 Zeitliche Expression 43
2.1.5.3 Räumliche Verteilung 43
2.1.5.4 Funktionelle Analyse 44
2.2 Kollagen XXVIII 47
2.2.1 Genstruktur und Phylogenie 47
2.2.2 Zeitliche Expression 49
2.2.3 Räumliche Verteilung 50
2.2.4 Funktionelle Analyse 51
2.2.4.1 Entwicklung der langsamen Muskulatur 53
2.2.4.2 Entwicklung des Kopfskeletts 55
3 Diskussion 57
3.1 AMACO, ein Protein mit ungewöhnlichen Eigenschaften 57
3.1.1 Die Gewebeverteilung von AMACO ist sehr spezifisch 57
3.1.1.1 AMACO ist in der Haut mit der Basalmembran assoziiert 57
3.1.1.2 AMACO assoziiert in der Niere an spezifischen Basalmembranen 58
3.1.2 Murines, nicht aber humanes AMACO vermittelt Zelladhäsion 59
3.1.3 AMACO ist kein klassisches Adaptermolekül der extrazelulären Matrix 60
3.1.4 AMACO trägt seltene O-Glykane 62
3.1.4.1 AMACO ist N-und O-glykosyliert 62
3.1.4.2 AMACO ist O-glucosyliert und O-fucosyliert 63
3.1.5 Der Knockdown des AMACO-Gens im Zebrafisch führt zu keinem
offensichtlichen Phänotyp 66
3.1.6 Fazit 67
3.1.7 Ausblick 68
3.2 Kollagen XXVIII ist essentiell für die Entwicklung des Zebrafischs 70
3.2.1 Kollagen XXVIII ist im Zebrafisch konserviert 70
3.2.2 Kollagen XXVIII lokalisiert um das Neuralrohr und zwischen Myotom und Haut
72
3.2.3 Kollagen XXVIII-Morphants sind spezifisch 73
3.2.4 Kollagen XXVIII-Morphants zeigen starke Defekte in der Entwicklung 73
3.2.4.1 Die Morphants zeigen Symptome für einen Defekt der langsamen Muskulatur.73
3.2.4.2 Die Skelettentwicklung der Morphants ist gestört 74
3.2.4.3 Ist Kollagen XXVIII wichtig für die Migration der Neuralleistenzellen? 74
3.2.5 Fazit 76
3.2.6 Ausblick 76
II
Inhaltsverzeichnis
4 Material und Methoden 78
4.1 Material 78
4.1.1 Lösungen und Puffer 78
4.1.2 Bakterienstämme und Nährmedien 79
4.1.3 Klonierungs- und Expressionsvektoren 79
4.1.4 DNA-Längenstandards und Protein-Molekulargewichtsmarker 80
4.1.5 Oligoneukleotide / Primer 80
4.1.6 Morpholinos 81
4.1.7 Antikörper 82
4.2 Molekularbiologische Arbeiten 82
4.2.1 Herstellung und Lagerung von Bakterienkulturen 82
4.2.2 Herstellung von chemisch kompetenten Bakterien 83
4.2.3 Transformation von Bakterien durch Hitzeschock 83
4.2.4 DNA-Präperation aus Bakterienkulturen (Mini-Prep) 83
4.2.5 DNA-Präzipitation 84
4.2.6 Konzentrationsbestimmung von DNA 84
4.2.7 Agarosegelelektrophorese 84
4.2.8 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen oder Lösungen 84
4.2.9 Restriktionsverdau von DNA 85
4.2.10 Ligation von DNA 85
4.2.11 T/A Klonierung 85
4.2.12 Polymerasekettenreaktion (PCR) 86
4.2.13 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse 87
4.2.14 Extraktion von RNA aus Zebrafischen 87
4.2.15 Präzipitation von RNA 88
4.2.16 Herstellung von cDNA mittels der Reversen Transkriptase 88
4.2.17 RACE 88
4.2.18 Klonierung der Konstrukte 89
4.2.19 Mutagenese 90
4.3 Zellkulturarbeiten 91
4.3.1 Kultivierung und Expansion von Zelllinien 91
4.3.2 Kryokonservierung von Zellen 91
4.3.3 Transfektion von Zelllinien 91
4.3.4 Ernte serumfreier, konditionierter Überstände 92
4.3.5 Zeiladhäsionsversuche 92
4.4 Proteinchemische Methoden 93
4.4.1 Affinitätsreinigung rekombinanter Proteine 93
4.4.2 Herstellung und Affinitätsreinigung von Antikörpern 94
4.4.3 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen 94
4.4.4 Präzipitation von Proteinen 95
III
Inhaltsverzeichnis
4.4.5 SDS-Polyacrylamidelektrophorese 95
4.4.6 Coomassie Färbung von Proteinen 96
4.4.7 Western Blot 96
4.4.8 Immundetektion von Proteinen auf Membranen 96
4.4.9 Abspaltung von N-Glykanen 97
4.4.10 Glykannachweis 97
4.4.11 ELISA-ähnliche Bindeversuche 98
4.5 Massenspektrometische Methoden 98
4.5.1 LC-MS/MS Analyse tryptischer Peptide 99
4.5.2 Reduktive ß-Eliminierung von Glykanaddukten 100
4.5.3 Analyse der O-Glykane mittels Massenspektrometrie 100
4.5.4 Methylierungsanalyse 101
4.6 Histologische Methoden 101
4.6.1 Herstellung von Gefrierschnitten 101
4.6.2 Herstellung von Parraffinschnitten 102
4.6.3 Entparaffinierung 102
4.6.4 Immunnachweis von Proteinen mittels Färbereaktion 102
4.6.5 Immunnachweis mittels Fluoreszenz gekoppeltem Zweitantikörper 103
4.6.6 Alcianblaufärbung von Zebrafischembryonen 103
4.6.7 Hämatoxylin, Eosin Alcianblau (HE+A) Färbung 103
4.7 Arbeit mit Zebrafischen 104
4.7.1 Haltung und Vermehrung 104
4.7.2 Injizierung von Morpholinos in Zebrafische 105
5 Zusammenfassung 106
6 Abstract 108
7 Literaturverzeichnis 110
Anhang 117
Danksagung 120
Teilpublikationen 122
Erklärung 123
Lebenslauf 124
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