Molekulare und systemische Aspekte der Strobilation bei Aurelia aurita:
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2008
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen VI
1. Einleitung
1.1 Cnidaria als Modellorganismen 1
1.2 Morphologie und Entwicklung von Aurelia aurita 2
1.2.1 Strobilation bei Aurelia aurita 4
1.2.2 Induktion der Strobilation 6
1.3 Problemstellung 7
1.4 Zielsetzung 8
2. Material und Methoden
2.1 Tierkulturen 9
2.1.1 Hälterung von Aurelia aurita 9
2.1.2 Medien 9
2.1.3 Auslösen der Strobilation 9
2.1.4 Definition der Stadien der Strobilation 9
2.2 Untersuchungen zu Systemeigenschaften 10
2.2.1 Schnittexperimente 10
2.2.2 Inkubationen bei verschiedenen Temperaturen 11
2.2.3 Inkubationen mit Kaliumiodid 11
2.3 Molekularbiologische Standardmethoden 11
2.3.1 Klonierung von DNA-Fragmenten 11
2.3.1.1 Restriktionsverdau von Nukleinsäuren 11
2.3.1.2 Elektrophorese von DNA-Fragmenten 12
2.3.1.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 12
2.3.1.4 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 12
2.3.1.5 Aufreinigung von Nukleinsäuren 12
2.3.1.6 Herstellung eines T/A Klonierungsvektors 13
2.3.1.7 Ligation 13
2.3.1.8 Transformation 13
I
Inhaltsverzeichnis
2.3.1.9 Blau-Weiß-Selektion 14
2.3.1.10 Herstellung kompetenter Bakterien 15
2.3.1.11 Plasmid-Minipräparation 15
2.3.1.12 Sequenzierung mit Fluoreszenzmarkierung 16
2.3.1.13 Sequenzvergleich 17
2.3.2 PCR-Techniken 17
2.3.2.1 Standard-PCR 17
2.3.2.2 RACE-PCR 18
2.3.2.3 Verwendete Primer 18
2.3.3 Arbeiten mit RNA 19
2.3.3.1 Isolierung von poly(A)* mRNA 19
2.3.3.2 Reverse Transkription - cDNA Synthese 19
2.3.3.3 Elektrophorese von RNA 19
2.3.3.4 Northern Blotting 20
2.3.3.5 in vitro Transkription für DIG-markierte RNA-Sonden 21
2.3.3.6 Überprüfung der DIG-Markierung der RNA-Sonden 21
2.3.4 Arbeiten mit radioaktiven Nukleotiden 22
2.3.4.1 Radioaktiv markierte DNA-Sonden 22
2.3.4.2 Hybridisierung radioaktiv markierter Sonden an
membrangebundene Nukleinsäuren 23
2.3.4.3 Autoradiogramme 24
2.3.5 cDNA-Phagen-Bibliothek 24
2.3.5.1 Herstellung einer cDNA-Phagen-Bibliothek 24
2.3.5.2 Sichten von cDNA-Bibliotheken 25
2.3.5.3 in vivo Excision von Phagen-Bibliotheken 25
2.4 Subtraktion von cDNA-Fragmenten 25
2.4.1 Ausgangsmaterial 26
2.4.2 Gewinnung der cDNA-Fragmente 27
2.4.3 Ligation der Adapter 27
2.4.4 Herstellung der Treiber- und Tester-Pools mittels PCR 27
2.4.5 Präparierung von Treiber und Tester 27
2.4.6 Subtraktive Hybridisierung 28
2.4.7 Herstellung der Differenzprodukte 28
2.4.8 Klonierung der Differenzprodukte 28
II
Inhaltsverzeichnis
2.4.9 Spezifität der RDA-Produkte 29
2.4.10 Sichten der Subtraktionsbibliothek 29
2.5 Histologische Methoden 29
2.5.1 RNA-/n s/fu-Hybridisierung 29
2.5.1.1 Protokoll In s/fu-Hybridisierung bei Aurelia aurita 30
2.5.2 Mikroskopie und Dokumentation 32
3. Ergebnisse
3.1 Untersuchungen zu Systemeigenschaften der Strobilation 33
3.1.1 Morphologische Merkmale der Strobilation 33
3.1.2 Strobilation bei abnormen Polypen 34
3.1.3 Schnittexperimente 38
3.1.3.1 Strobilationsinduktion von quergeteilten Polypen 38
3.1.3.2 Strobilationsinduktion von längsgeteilten Polypen 40
3.1.3.3 Induktion basaler Hälften von Strobilae 41
3.1.3.4 Auswirkungen der Längsteilung von Strobilae
auf die Strobilation 42
3.1.4 Temperaturversuche 43
3.1.4.1 Inkubation bei 31°C 43
3.1.4.2 Inkubation bei 30°C 45
3.1.4.3 Inkubation bei 29°C 45
3.1.4.4 Polypenstrobilae 46
3.1.4.5 Verhinderung der Strobilation durch Inkubation bei 30°C/ 31 °C 49
3.1.4.6 Rückumwandlung von Ephyren in Polypen 52
3.1.4.7 Zusammenfassung der Auswirkungen 53
3.1.5 Kaliumiodid fördert den Strobilationsablauf bei 30°C 54
3.2 Molekularbiologische Untersuchungen 56
3.2.1 Untersuchungen von cDNA-Fragmenten einer bestehenden
Subtraktionsbibliothek (Siefker, 2004) 56
3.2.1.1 Expressionsanalyse mittels RNA-/n s/fu-Hybridisierung 56
3.2.1.2 Expressionsanalyse des cDNA-Fragments SAa 96 61
3.2.1.3 Sichten von c-DNA-Phagenbibliotheken 62
3.2.1.4 Sequenzanalysen der SAa-cDNA-Fragmente 63
III
Inhaltsverzeichnis
3.2.2 PCR gestützte Subtraktionsbibliothek 64
3.2.2.1 Differenzprodukte der Subtraktionsbibliothek 64
3.2.2.2 Spezifität der Subtraktionsbibliothek 66
3.2.2.3 Sequenzanalysen von Klonen des DP3 67
3.2.2.4 Sichtung der ersten Subtraktionsbibliothek 67
3.2.2.5 Spezifität der RDA-Fragmente und deren Sequenzanalysen 68
3.2.2.6 Sichtung der zweiten Subtraktionsbibliothek 69
3.2.3 Expressionsanalysen von RDA-Fragmenten 70
3.2.3.1 RDA-Fragment A 70
3.2.3.2 RDA-Fragmente B / C / D / G 72
3.2.3.3 RDA-Fragment E 74
3.2.3.4 RDA-Fragment F 75
3.2.3.5 Vergleich der Expressionsdomänen der RDA-Fragmente 78
3.2.3.6 Weitere Expressionsanalysen von RDA-Fragmenten 79
3.2.4 Einfluss erhöhter Temperatur auf die Expressionsmuster 80
3.2.5 Sequenzanalysen von RACE Produkten derRDA-Fragmente 82
4. Diskussion
4.1 Systemeigenschaften der Strobilation 83
4.1.1 Der Zusammenhang zwischen Segmentierung und
Metamorphose während der Strobilation 83
4.1.2 Strukturelle Bedingungen für die Induktion der Strobilation 84
4.1.3 Vergleich der Musterbildung der Strobilation nach
Längsschnitten vor und nach Einsetzen der Strobilation 86
4.1.4 Kopfstrukturen strobilieren immer 88
4.1.5 Sonderformen bei Ephyren 89
4.2 Zusammenhang von Temperatur und Strobilationsablauf 90
4.2.1 Einfluss der Umgebungstemperatur auf die Strobilation 90
4.2.1 Der Einfluss der erhöhten Temperaturen von 30°C / 31 °C
auf die Strobilationsprozesse 92
4.2.3 Die Temperaturschwelle bei 30°C 93
4.2.4 Kaliumiodid kann die Folgen erhöhter
Temperaturen kompensieren 94
IV
Inhaltsverzeichnis
4.2.5 Polypenstrobila als Folge erhöhter Temperatur
während der Strobilation 96
4.2.6 Die Rückumwandlung von Ephyren in Polypen ist
eine Form der reversen Entwicklung 97
4.3 Molekularbiologische Aspekte 98
4.3.1 Aus der Subtraktionsbibliothek konnten
strobilationsspezische cDNA-Fragmente isoliert werden 98
4.3.2 Die räumlichen Expressionsanalysen können Hinweise
auf mögliche Funktionen der repräsentierten Gene geben 99
4.3.3 Sequenzanalysen liefern keine relevanten Homologien 103
4.4 Fazit und Ausblick 105
5. Literatur 106
6. Zusammenfassung 110
7. Abstract 111
8. Anhang 112
Danksagung
Erklärung
Lebenslauf
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