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Chips und ASAP1: funktionelle Genomik der Tumormetastasierung

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Bibliographic Details
Main Author:	Müller, Thomas 1970- (Author)
Format:	Thesis Book
Language:	German
Published:	Karlsruhe FZKA 2005
Edition:	Als Ms. gedr.
Series:	Forschungszentrum Karlsruhe / Wissenschaftliche Berichte Forschungszentrum Karlsruhe /
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adam_text	FORSCHUNGSZENTRUM KARLSRUHE IN DER HELMHOLTZ-GEMEINSCHAFT WISSENSCHAFTLICHE BERICHTE FZKA 7159 CHIPS UND ASAP1: FUNKTIONEILE GENOMIK DER TUMORMETASTASIERUNG THOMAS MUELLER INSTITUT FUER TOXIKOLOGIE UND GENETIK VON DER FAKULTAET FUER CHEMIE UND BIOWISSENSCHAFTEN DER UNIVERSITAET KARLSRUHE (TH) GENEHMIGTE DISSERTATION FORSCHUNGSZENTRUM KARLSRUHE GMBH, KARLSRUHE 2005 ULB DARMSTADT IIIIILLLLLLLLLLL 16249297 INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG 1 1.1 VORBEMERKUNG 1 1.2 KREBS 1 1.3 METASTASEN 2 1.4 DIE METASTATISCHE KASKADE 2 1.5 ADHAESION, INVASION UND MOTILITAET VON TUMORZELLEN 4 1.5.1 EMT (EPITHELIALER-ZU-MESENCHYMALER UEBERGANG) 4 1.5.2 ADHAESION 4 1.5.3 PROTEOLYSE 6 1.5.4 MIGRATION 7 1.5.5 TUMORE UND ANGIOGENESE 7 1.5.6 LYMPHANGIOGENESE 8 1.6 ZU DIESER ARBEIT 8 1.6.1 ZUGRUNDE LIEGENDE HYPOTHESE 8 1.6.2 SSH - SUBTRAKTIVE SUPPRESSIVE HYBRIDISIERUNG 9 1.6.3 TUMORPROGRESSIONSSYSTEME 10 1.6.3.1 DAS BSP73-RATTENADENOKARZINOMSYSTEM (PANKREAS) 10 1.6.3.1.1BESTAETIGUNG DES METASTATISCHEN POTENTIALS DER BSP73-ZELLLINIEN 11 1.6.3.2 DAS 13762NF-RATTENADENOKARZINOMSYSTEM (BRUST) 12 1.6.3.3 DAS DUNNING R3327 RATTENADENOKARZINOMSYSTEM (PROSTATA) 12 1.6.4 HINTERGRUND DER BEIDEN ZU UNTERSUCHENDEN SUBTRAKTIVEN BIBLIOTHEKEN 14 1.6.5 DNA-MIKROARRAYS 15 1.6.6 CHARAKTERISIERUNG EINES METASTASEN-ASSOZIIERTEN GENS 16 1.6.6.1ARF-GAP-FAMILIE (CENTAURINE) 16 1.6.6.2ARF-PROTEINE 16 1.6.6.3AUFBAU VON ASAP1 17 1.6.6.4 FUNKTIONEN VON ASAP1 IN DER ZELLE 17 1.7 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 19 2. MATERIAL UND METHODEN 21 2.1 BEZUGSQUELLEN DER CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 21 2.2 GERAETE 23 2.3 RADIOCHEMIKALIEN 24 2.4 ANTIKOERPER 24 2.4.1 PRIMAERANTIKOERPER: 24 2.4.2 SEKUNDAERANTIKOERPER: 24 2.5 PLASMIDE 24 2.6 OLIGONUKLEOTIDE 24 2.7 PRO- UND EUKARYOTISCHE ZELLLINIEN 25 2.7.1 PROKARYOTISCHE ZELLEN: 25 2.7.2 EUKARYOTISCHE ZELLEN: 25 2.8 DNA-METHODEN 26 2.8.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 26 INHALTSVERZEICHNIS V 2.8.2 PHENOL/CHLOROFORM EXTRAKTION 26 2.8.3 FAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN 26 2.8.4 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 26 2.8.5 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 26 2.8.6 PLASMID DNA MINI-PRAEPARATION 27 2.8.7 PLASMID-DNA MAXI-PRAEPARATION 27 2.8.8 PCR-ANSAETZE 27 2.8.9 SCHNEIDEN VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 28 2.8.10 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA 28 2.8.11 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 28 2.8.12 TOPO-KLONIERUNG 29 2.8.13 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON CDNA 29 2.9 GEBRAUCH EINES MATCHED TUMOR/NORMAL EXPRESSION ARRAY 29 2.10 PRAEPARATION ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIEN 29 2.11 TRANSFORMATION DURCH ELEKTROPORATION: 29 2.12 RNA METHODEN 30 2.12.1 PRAEPARATION VON GESAMT-RNA AUS ZELLEN UND GEWEBE 30 2.12.2 PRAEPARATION VON POLYA-I- -RNA AUS ZELLEN 30 2.12.3 RNA - AGAROSE - GELELEKTROPHORESE 30 2.12.4 NORTHERN BLOT: TRANSFER VON RNA AUF NYLONMEMBRAN 31 2.12.5 NORTHERN-HYBRIDISIERUNG 31 2.12.6 HERSTELLUNG VON CDNA AUS POLYA+ -RNA 31 2.12.7 IN SITU HYBRIDISATION 32 2.13 METHODEN FUER DIE HERSTELLUNG UND BENUTZUNG VON DNA-MIKROARRAYS 32 2.13.1 REINIGUNG DES AMPLIKONS UND KONTROLLE DER PCR-REAKTION 32 2.13.2VORLAGE IN 384-WELL MIKROTITERPLATTEN FUER DEN KONTAKTSPOTTER 32 2.13.3 FLUORESZENZMARKIERUNG VON DNA UND HYBRIDISIERUNG 32 2.13.4 HYBRIDISIERUNG 33 2.13.5WASCHEN DER MIKROARRAYS 33 2.13.6 AUSLESEN MIT DEM AXON 4000B 33 2.13.7 STATISTISCHE AUSWERTUNG 34 2.14 PROTEINMETHODEN 35 2.14.1 PRAEPARATION VON ZELLEN UND GEWEBE FUER PROTEINGELE 35 2.14.2AUFTRENNUNGVON PROTEINEN IN SDS-POLYACRYLAMIDGELEN (SDS-PAGE) 35 2.14.3COOMASSIE-BRILLIANT-BLAU-FAERBUNG VON PROTEINEN NACH SDS-PAGE 35 2.14.4 ANALYSE VON PROTEINEN DURCH TRANSFER AUF MEMBRANEN UND DETEKTION DURCH SPEZIFISCHE ANTIKOERPER (WESTERN BLOT) 36 2.14.5 RADIOAKTIVE IMMUNPRAEZIPITATION VON PROTEINEN (HOT-IP) 36 2.14.6 ELISA (ENZYME-IINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) 37 2.14.7 IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG VON PROTEINEN 37 2.14.8 IMMUNHISTOCHEMIE 37 2.15 ANTIKOERPERPRODUKTION UND AUFREINIGUNG 38 2.15.1 AUFREINIGUNG DES HUASAPL-GST-FUSIONSPROTEINS 38 2.15.2 IMMUNISIERUNG VON MAEUSEN ZUR HERSTELLUNG MONOKLONALER ASAPL-ANTIKOERPER 39 2.15.3VORBEREITUNGDER HYBRIDOM-BILDUNG 39 2.15.4 HYBRIDOM-BILDUNG 39 2.15.5TESTEN DER KLONE 40 VI INHALTSVERZEICHNIS 2.15.6AUFREINIGUNG DER ANTIKOERPER 40 2.16 BENUTZUNG EINES SH3 TRANSIGNAL SH3 DOMAIN ARRAY 40 2.17 ZELLKULTURMETHODEN 40 2.17.1 PASSAGIEREN VON ZELLEN 40 2.17.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN 40 2.17.3STABILE UND TRANSIENTE TRANSFEKTIONEN MIT GENEPORTER 41 2.17.4ERMITTLUNG DER TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ 41 2.18FUNKTIONELLE IN VITRO METHODEN 41 2.18.1WUNDHEILUNGSEXPERIMENT (KRATZASSAY) 41 2.18.2ADHAESIONSEXPERIMENTE 42 2.18.3 PROLIFERATIONSEXPERIMENTE 42 2.18.4 ERMITTLUNG DER APOPTOSERATE 42 2.19 TIERMETHODEN 42 2.19.1TUMORWACHSTUM UND METASTASIERUNGSEXPERIMENTE IN RATTEN 43 3. ERGEBNISSE 45 3.1 CHARAKTERISIERUNG ZWEIER SUBTRAKTIVER BIBLIOTHEKEN 45 3.1.1 DNA-MIKROARRAY-DESIGN 45 3.1.2 AMPLIFIZIERUNG UND AUFREINIGUNG DER SSH-KLONE 46 3.1.3 SPOTTEN DER SSH-KLONE AUF DIE GLASCHIPS 47 3.1.4 AUSWAHL DER ZELLLINIEN FUER DIE HYBRIDISATION DER DNA-MIKROARRAYS 48 3.1.5 HYBRIDISATION UND AUSWERTUNG DER DNA-ARRAYS 49 3.2 CHARAKTERISIERUNG VON ASAP1 51 3.2.1 DIFFERENTIELLE EXPRESSION VON ASAP1 IN RATTENTUMORPROGRESSIONSMODELLEN 51 3.2.2 ASAPL-EXPRESSIONSSTUDIEN IN HUMANEN TUMOREN IM VERGLEICH ZU NORMALGEWEBEN 52 3.2.3 IN SITU HYBRIDISATION VON MENSCHLICHEN TUMORSCHNITTEN MIT FLUORESZENZ-MARKIERTER ASAPL-MRNA 55 3.2.4 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTI-ASAPL-ANTIKOERPER 57 3.2.4.1 PRAEPARATION EINES ASAPL-GST-FUSIONSPROTEINS 57 3.2.4.2TESTEN DER IN DEN HYBRIDOMUEBERSTAENDEN ENTHALTENEN ANTIKOERPER 57 3.2.5. CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN ANTI-ASAPL-ANTIKOERPER 58 3.2.5.1 STRIP WESTERNS MIT AUFGEREINIGTEM PROTEIN ZUM TESTEN DER ANTI-ASAPL- ANTIKOERPER 59 3.2.5.2 EXPRESSION VON ASAP1 IN MENSCHLICHEN KOLONKARZINOMZELLEN 60 3.2.5.3 MONOKLONALE ANTI-HUMAN-ASAPL-ANTIKOERPER KREUZREAGIEREN MIT RATTEN-ASAPL 60 3.2.5.4 DIFFERENTIELLE EXPRESSION VON ASAP1 IM BSP73 PANKREASSYSTEM DER RATTE 61 3.2.5.5 IMMUNPRAEZIPITATION VON ASAP1 61 3.2.5.6 BESTIMMUNG DER LOKALISATION VON ASAPL-PROTEIN IN DER ZELLE UEBER IMMUNFLUORESZENZ 62 3.2.5.7 IMMUNOHISTOCHEMIE (IHC) MIT MONOKLONALEN ANTI-ASAPL-ANTIKOERPERN AUF HUMANEN SW1116-KOLONKARZINOM-TUMORSCHNITTEN 64 3.2.5.8 IMMUNOHISTOCHEMIE (IHC) MIT MONOKLONALEN ANTI-ASAPL-ANTIKOERPERN AUF ASML- RATTENTUMORSCHNITTEN 66 3.2.5.9ZUSAMMENFASSUNG DER ANTI-ASAPL-ANTIKOERPER-CHARAKTERISIERUNG 67 3.2.6 IMMUNOHISTOCHEMISCHE ANALYSEN MENSCHLICHER TUMOR-/NORMALGEWEBE ZEIGEN, DASS ASAP1 IN TUMOREN HOCHREGULIERT IST. 68 3.2.7. ISOLATION DER KOMPLETTEN LAENGE DER RATTEN-ASAPL-CDNA 70 3.2.7.1. 5 - RACE 70 3.2.7.2. IDENTIFIKATION DREIER SPLEISSVARIANTEN VON RASAPL 72 INHALTSVERZEICHNIS VII 3.2.8 FUNKTIONELLE ANALYSEN VON ASAPL 74 3.2.8.1 HINTERGRUND ZU DEN ASAPL-KONSTRUKTEN 74 3.2.8.2. ADHAESION 75 3.2.8.2.1TRANSIENT TRANSFIZIERTES RASAPL ERHOEHT DIE ADHAESION VON LAS-TUMORZELLEN ZU FIBRONEKTIN 77 3.2.8.3 ZELLSTRECKUNG IN VITRO 79 3.2.8.4 IN VITRO WUNDHEILUNGSVERSUCH 80 3.2.8.5. PROLIFERATION 82 3.2.8.6 APOPTOSE 86 3.2.9. IDENTIFIKATION VON ASAPL-INTERAKTIONSPARTNERN ANHAND EINES SH3-DOMAIN-ARRAYS 88 3.2.10TIERVERSUCHE ZUR IN VIVO ANALYSE VON MIT ASAPL-KONSTRUKTEN STABIL TRANSFIZIERTEN 1AS- UND ASML-RATTENTUMORZELLEN 90 3.2.10.1GENERATION STABIL TRANSFIZIERTER ASAPL UEBEREXPRIMIERENDER ZELLLINIEN 90 3.2.10.2. IN VIVO ANALYSE VON MIT ASAPL-KONSTRUKTEN STABIL TRANSFIZIERTEN 1AS- RATTEN- TUMORZELLEN 92 3.2.10.3 IN VIVO ANALYSE VON MIT ASAPL-KONSTRUKTEN STABIL TRANSFIZIERTEN ASML-RATTEN- TUMORZELLEN 96 4. DISKUSSION 99 4.1 CHARAKTERISIERUNG ZWEIER SUBTRAKTIVER BIBLIOTHEKEN DURCH DNA-MIKROARRAYS 99 4.2 IDENTIFIKATION METASTASEN-ASSOZIIERTER GENE 99 4.3 CHARAKTERISIERUNG DES METASTASEN-ASSOZIIERTEN GENS ASAPL 101 4.3.1 ASSOZIATION DER ASAPL-EXPRESSION ZUM NEOPLASTISCHEN PHAENOTYP 101 4.3.2 MODULATIONEN FUER DIE METASTASIERUNG WICHTIGER ZELLFUNKTIONEN DURCH ASAPL 101 4.3.3 BEEINFLUSSUNG DES METASTATISCHEN PHAENOTYPS DURCH ASAPL 101 4.4 MOEGLICHE MECHANISMEN DER TUMORPROGRESSION UND METASTASIERUNG 102 5. LITERATURVERZEICHNIS A-L ABBILDUNGEN UND TABELLEN A-XL VIII INHALTSVERZEICHNIS
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