Regeneration des Herzmuskels: Studien zum Zellzyklusarrest in Herzmuskelzellen
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Aachen
Shaker
2001
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung und Problemstellung 1
1.1 Klinischer Hintergrund 1
1.2 Potentielle Strategien zur Regeneration des Myokards 2
1.2.1 Transplantation von Schweineherzen (Xenotransplantation) 2
1.2.2 Zelltransplantation 3
1.2.3 Transdifferenzierung 5
1.2.4 Reinduktion der Proliferation adulter Kardiomyozyten S
1.3 Zellzyklusregulation 6
1.3.1 Proliferationskontrolle in somatischen Zellen 6
1.3.2 Regulation der terminalen Differenzierung 11
1.3.3 Zellzyklusfaktoren und Zellzyklusregulation in Kardiomyozyten 13
1.4 Problemstellung 16
2. Material 17
2.1 Geräte 17
2.2 Chemikalien 19
2.3 Biologisches Material 20
2.4 Lösungen, Puffer und Medien 21
3. Methoden 27
3.1 Isolierung und Kultivierung von Primärzellen aus Rattenherzen 27
3.1.1 Neonatale ventrikuläre Kardiomyozyten und kardiale Nicht-Myozyten 27
3.1.2 Adulte Kardiomyozyten des linken Ventrikels 27
3.2 Zellkultur 29
3.2.1 Kultivierung 29
3.2.2 Passagieren von Zellkulturen 30
3.2.3 Bestimmung der Lebendzellzahl 30
3.2.4 Langzeitkonservierung 30
3.2.5 Synchronisation 30
ITThal*fVTyjrirhnis — D
3.3 Durchflußzytometrische Analysen 31
3.3.1 Propidiumjodidfärbung 31
3.3.2 Maildeimg von Zellkulturen niit 5-Brom-2 -Desoxyuridin 31
3.3.3 Tropomyosinfärbung 31
3.4 Methoden zur Proteinanalyse 32
3.4.1 Präparation von Zellextrakten und Zellkernen 32
3.4.2 Bestimmung des Proteingehaltes von Zellextrakten 32
3.4.3 Immundepletion 33
3.4.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 33
3.4.5 Standard-Coomassie-Färbung 34
3.4.6 Western-Blot-Analyse 34
3.4.7 Chemolumineszenz-Verfahren 34
3.4.8 Messung der cyclinabhängigen Kinaseaktivität 35
3.5 Kerninkubationsexperimente 36
3.5.1 Immobilisierung isolierter Zellkerne 36
3.5.2 Kerninkubation 36
3.5.3 Hitzeinaktivierung zytoplasmatischer Extrakte 36
3.6 Indirekte Immunfluoreszenz 37
3.6.1 Fixierung und Permeabilisienmg 37
3.6.2 Färbung und lichtmikroskopische Analyse 37
3.7 Apoptosenachweis mittels TUNEL-Test 38
3.8 Expression und Aufreinigung rekombinanter Proteine 38
3.8.1 Kultivierung von Bakterien 38
3.8.2 Herstellung kompetenter Bakterien 38
3.8.3 Transformation von Bakterien 39
3.8.4 Präparative Plasmidisolierung 39
3.8.5 Spektralphotometrische Messung von Nukleinsäuren 39
3.8.6 Proteinexpression und Aufreinigung 39
3.9 Transfektion von Zellkulturen mit rekombinantem Adenovirus 40
3.10 Statistische Analyse 40
Inhaltsverzeichnis JH
4. Ergebnisse 41
4.1 Zellfreies System zur Induktion der DNA-Synthese 41
4.2 Isolation von Kardiomyozyten aus Rattenherzen 42
4.2.1 Charakterisierung der Präparation neonataler Kardiomyozyten 42
4.2.2 Charakterisierung der Präparation adulter Kardiomyozyten 44
4.3 Analyse der Synchronisation von H9c2-Zellen und Nicht-Myozyten 44
4.4 Induktion der DNA-Synthese in isolierten neonatalen Kardiomyozyten-
kernen im zellfreien System 47
4.4.1 Induktion der PCNA-Expression und des Biotin-16-dUTP-Einbaus 47
4.4.2 Abhängigkeit der Induktion der DNA-Synthese von nuklearen und
zytoplasmatischen S-Phase-Faktoren sowie der de novo Proteinsynthese 49
4.5 Studien zur Regulation des nuklearen Imports von rekombinantem CyS-
markiertem CDK2-Protein im zellfreien System 51
4.6 Induktion der DNA-Synthese in isolierten adulten Kardiomyozytenkernen
im zellfreien System 52
4.6.1 Induktion der PCNA-Expression und des Biotin-16-dUTP-Einbaus 52
4.6.2 Expressionsmuster von p21CIP1, p27KIP1 und PCNA 56
4.7 Zellfreies System zur Inhibition der DNA-Synthese 59
4.8 Inhibition der DNA-Synthese in S-Phase-Kernen durch zelluläre Extrakte
aus isolierten adulten Kardiomyozyten 60
4.8.1 Abnahme des anti-PCNA-Immunfluoreszenzsignals in H9c2-Kernen 60
4.8.2 Abnahme des anti-PCNA-Immunfluoreszenzsignals in Kernen
von Nicht-Myozyten 63
4.8.3 Inhibition des Biotin-16-dUTP-Einbaus 64
4.9 Charakterisierung des inhibitorischen Effekts von zytoplasmatischem Extrakt
aus adulten Kardiomyozyten 66
4.9.1 Der inhibitorische Effekt beruht nicht auf der Induktion von Apoptose
im zellfreien System 66
4.9.2 Der inhibitorische Effekt ist hitzesensitiv 68
4.9.3 Der inhibitorische Effekt kann durch einen Oberschuß an zytoplasma¬
tischem Extrakt von S-Phase-Zellen aufgehoben werden 70
4.9.4 Der zytoplasmatische Extrakt von serumstimulierten adulten
Kardiomyozyten zeigt keinen inhibitorischen Effekt 71
InhaltsvM-mirhnis _ E
4.10 Der inhibitorische Effekt von zytoplasmatischem Extrakt adulter Kardiomyo¬
zyten ist von p21cn 1 abhängig 74
4.10.1 P21cn 1-depletietter zytoplasmatischer Extrakt adulter Kardiomyozyten
hat keinen inhibitorischen Effekt 74
4.10.2 Zusatz von rekombinantem GST-p21CIP1 zu p21cn 1-depletiertem
Extrakt stellt den inhibitorischen Effekt wieder her 75
4.10.3 GST-p21CIP1 ist ausreichend für die Inhibition der DNA-Synthese im
zellfreien System 78
5. Diskussion und Ausblick 81
5.1 Regulation des Differenzierungszustandes von Kardiomyozyten durch Proteine
der Retinoblastom-Genfamilie und Inhibitoren cyclinabhängiger Kinasen 81
5.2 Der Zellzyklusarrest terminal differenzierter Kardiomyozyten ist reversibel 83
5.2.1 Vergleich der verschiedenen Systeme zur Induktion der DNA-Synthese
in Kardiomyozyten 83
5.2.2 Vergleich verschiedener zellfreier Systeme zur Induktion der DNA-
Synthese in ruhenden bzw. differenzierten Zellen 85
5.3 Der Zellzyklusarrest von Kardiomyozyten wird durch Inhibitorproteine
aufrechterhatten 87
5.3.1 Die Inhibition der DNA-Synthese ist ein Regulationsmechanismus,
der zum Zellzyklusarrest in Kardiomyozyten beitragt 87
5.3.2 P21cn i und nicht p27Kn 1 kontrolliert über PCNA die Inhibition der
DNA-Synthese und damit den Zellzyklusarrest in Kardiomyozyten 89
6. Zusammenfassung 93
7. Literaturverzeichnis 94
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