Intrazellulärer Transport eines heterologen Membranproteins in Hefe: der humane Transferrinrezeptor als Modell
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Aachen
Shaker
2000
|
| Schriftenreihe: | Berichte aus der Biologie
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| Schlagworte: | |
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| Beschreibung: | IV, 161 S. Ill., graph. Darst. |
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Der Transport 1
1.1.1 Vesikelbildung 2
1.1.2 Vesikelverschmelzung 6
1.2 Die transportierten Proteine 10
1.2.1 Plasmamembranproteine und deren aktive Entfernung 10
1.2.2 Signale für die aktive Entfernung 12
1.3 Die Qualitätskontrolle im ER 14
1.3.1 Die Aufgaben des Endoplasmatischen Retikulums bei der
Bereitstellung von funktionstüchtigen Proteinen 15
1.3.2 Die Degradation von funktionsuntüchtigen Proteinen im ER 17
1.3.3 Chaperone,dieHilfsproteineim ER 19
1.4 Die Anwendung der Transport- und Degradations-Kenntnisse für die
Expression heterologer Proteine in der Hefe Saccharomyces cerevisiae 26
2 Problemstellung 32
2.1 Der humane Transferrinrezeptor 32
2.2 Die Rezeptor-vermittelte Endocytose 32
2.3 Ein Screeningsystem für die Optimierung der Rezeptor¬
vermittelten Endocytose 33
2.4 Aufgabenstellung 34
3 Material und Methoden 36
3.1 Material 36
3.1.1 Primer 36
3.1.2 Plasmide 36
3.1.3 Stämme 37
3.1.4 Medien 37
3.1.5 Puffer, Lösungen, Chemikalien 38
3.2 Methoden der DNA-Analyse 39
3.2.1 Restriktion 39
3.2.2 Agarose-Gelelektrophorese 39
3.2.3 Gelelution 39
3.2.4 Phenol-Chloroform-Extraktion 40
3.2.5 DNA-Fällung 40
3.2.6 Alkalische Phosphatase Behandlung 40
3.2.7 Ligation 40
II
3.2.8 E.coliTransformation 40
3.2.9 Plasmid-Isolation aus E.coli (Minipräp) 41
3.2.10 Plasmid-Aufarbeitung aus E. coli (Maxipräp) 41
3.2.11 Hefe-Transformation 41
3.2.12 DNA-Isolation aus S. cerevisiae 41
3.2.13 PCR 42
3.2.14 Southern-Blot 42
3.2.15 Hybridisierung des Southern-Blot 43
3.3 Methoden der RNA-Analyse 43
3.3.1 RNA-Aufarbeitung aus S. cerevisiae 43
3.3.2 Denaturierende Agarosegele 44
3.3.3 Northern-Blot 44
3.3.4 Hybridisierung des Nothern-BIot 44
3.4 Methoden der Protein-Analyse 44
3.4.1 Proteinaufarbeitung 44
3.4.2 Proteinbestimmung nach Bradford 45
3.4.3 SDS-PAGE(SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese) 45
3.4.4 Western-Blot (semi dry) und Dot Blot 46
3.4.5 Coomassie-Färbung 46
3.4.6 Immundetektion 46
3.4.7 Rehybridisierung von Western Blots 47
3.4.8 Immunfluoreszenzmikroskopie 47
3.4.9 ELISA: Transferrin-Bindungsassay 48
3.4.10 Vakuolenisolation 48
3.4.11 Fraktionierung 49
3.4.12 Protoplasten-Fraktionierung 50
3.4.13 Enzymtests 50
3.4.14 Nachweis von Tf in Zellen 53
3.4.15 Endocytose-Test mit Lucifcr Yellow 54
4 Ergebnisse 55
4.1 Die Expression des Transferrinrezeptors 55
4.2 Transferrin-Bindung in vivo 63
4.3 Transport Bedingungen und Stabilität des TfR 68
4.3.1 Der Transport in Abhängigkeit von O-Quelle und Temperatur 68
4.3.2 Der Transport des TfR zur Vakuole 72
4.3.3 Der Zusammenhang zwischen Rezeptorsynthese und mRNA 74
4.3.4 Degradation des TfR in Gegenwart von Cycloheximid 77
III
4.4 Die Lokalisation des Rezeptors 78
4.4.1 Vakuolen-Isolation 78
4.4.2 Immunfluoreszenzmikroskopie 82
4.4.3 Gradienten-Fraktionierung 85
4.4.4 Protoplasten-Fraktionierung 95
4.5 Das TfR-GFP Fusionsprotein 97
4.6 Deletiondes Chaperons Cnelp 101
5 Diskussion 105
5.1 Die Bedeutung der Expressionssteuerung 105
5.2 Die Beeinflussung der Endocytose 108
5.3 Die Lokalisation des TfR 112
5.4 Der steady State und die Transportwege des TfR 117
5.5 Auswirkungen der Deletion des Chaperons Cnelp
auf den Transferrinrezeptor 121
5.6 Ausblick 123
6 Zusammenfassung 127
7 Literatur 128
Anhang 148
|
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