Identifizierung und Charakterisierung des E. coli moeB-Homologen cnx5 in Pflanzen, funktionelle Analyse des eukaryontischen Genproduktes, sowie der Untersuchung der Einflüsse anderer Stoffwechselwege auf die Molybdäncofaktor-Biosynthese:
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| adam_text | IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES E. COLI MOEB-HOMOLOGEN CNX5 IN
PFLANZEN, FUNKTIONEILE ANALYSE DES EUKARYONTISCHEN GENPRODUKTES, SOWIE
DIE UNTERSUCHUNG DER EINFLUESSE ANDERER STOFFWECHSELWEGE AUF DIE
MOLYBDAENCOFAKTOR- BIOSYNTHESE DER GEMEINSAMEN NATURWISSENSCHAFTLICHEN
FAKULTAET DER TECHNISCHEN UNIVERSITAET CAROLO-WILHELMINA ZU BRAUNSCHWEIG
ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER.
NAT.) GENEHMIGTE DISSERTATION VON JOERG NIEDER AUS SALZKOTTEN
INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS SEITE 1. EINLEITUNG 1 1.1. DIE
GESCHICHTE DES MOLYBDAENCOFAKTORS 1 1.2. MOLYBDOENZYME 2 1.3. DIE
STRUKTUR DES MOLYBDAENCOFAKTORS 5 1.4. DIE BIOSYNTHESE DES
MOLYBDAENCOFAKTORS 8 1.5. DER EINFLUSS DES MOLYBDAENCOFAKTORS AUF DIE 11
STOFFWECHSELPHYSIOLOGIE DER EUKARYONTENZELLE 2. ERGEBNISSE 13 2.1
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES PFLANZLICHEN GENS MITHOMOLOGIEN
13 ZUM E.COLI MOLYBDAENCOFAKTOR-GEN MOEB SOWIE ERSTE FUNKTIONELLE UNTER-
SUCHUNGEN DES GENPRODUKTES 2.1.1. ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG
PFLANZLICHER CDNA-KLONE MIT HOMOLOGIEN ZU 15 MOEB IN E.COLI 2.1.1.1.
IDENTIFIZIERUNG EINER HOMOLOGEN CDNA IN A.THALIANA 15 2.1.1.2.
IDENTIFIZIERUNG EINER HOMOLOGEN CDNA IN N.PLUMBAGINIFOLIA 19 2.1.1.3.
SEQUENZ-ALIGNMENT DER IDENTIFIZIERTEN PFLANZLICHEN KLONE MIT 21
MOEB-HOMOLOGEN PROTEINEN 2.1.1.4. DATENBANKANALYSE ZUR IDENTIFIZIERUNG
VON FUNKTIONEILEN SEQUENZMOTIVEN UND 26 POSTTRANSLATIONALEN
MODIFIKATIONSSTELLEN INNERHALB DES CNX5-PROTEINS 2.1.2. ISOLIERUNG UND
GENETISCHE CHARAKTERISIERUNG DES AUR5-GENS IN PFLANZEN 28 2.1.2.1. DIE
GENOMISCHEN SEQUENZEN VON CNX5 IN A.THALIANA UND N.PLUMBAGINIFOLIA 28
2.1.2.2. PROMOTORANALYSE DER GENOMISCHEN CNX5-SEQUENZ 31 2.1.2.3.
SEQUENZIERUNG DER GENOMISCHEN UMGEBUNG VON CNX5 UND MAPPING DES 33
CNJR5-LOCUS IN A.THALIANA 2.1.3. FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON CNX5
36 2.1.3.1. ANTISENSE-TRANSFORMATION VON CNX5 IN A.THALIANA 36 2.1.3.2.
UEBEREXPRESSION DES EUKARYONTISCHEN CNXS IN E.COLI 39 2.1.3.2.1.
ERSTELLUNG DER EXPRESSIONSKONSTRUKTE 39 INHALTSVERZEICHNIS 2.1.3.2.2.
FUNKTIONELLE KOMPLEMENTATION VON E.COLI MOLYBDAENCOFAKTOR-MUTANTEN 42
DURCH EUKARYONTISCHE CNX-CDNAS 2.1.3.2.3. UEBEREXPRESSION VON CNX5 IN
PICHIAPASTORIS 44 2.1.3.2.4. VERSUCH DER IN VITRO SYNTHESE DES
MOLYBDAENCOFAKTORS IM 46 NIT-L REKONSTITUTIONSASSAY 2.1.3.2.5. NACHWEIS
DER SULFURTRANSFERASE-AKTIVITAET DES IN PICHIA 50 UEBEREXPRIMIERTEN
HUMANEN CNX5 2.1.4. ISOLIERUNG WEITERER ESSENTIELLER BESTANDTEILE DER
EUKARYONTISCHEN 55 MOLYBDAENCOFAKTOR-BIOSYNTHESE DURCH DAS
HEFE-TWO-HYBRID-SYSTEM 2.1.4.1 TEST AUF EINE INTERAKTION ZWISCHEN DEN
PFLANZLICHEN PROTEINEN CNX5 UND CNX6 57 2.1.4.2. EINSATZ DER
PFLANZLICHEN GENE CNX5 UND CNX6 IM TWO-HYBRID-SCREEN 59 EINER AJHALIANA
CDNA-BANK 2.1.4.3. ISOLIERUNG VON CNX7 AUS A.THALIANA DURCH PARALLELE
INTERAKTION 63 MIT CNX5 UND CNX6 2.2. ISOLIERUNG UND FUNKTIONSAUFKLAERUNG
EINES CYSTATHIONIN-Y-SYNTHASE 65 HOMOLOGEN PROTEINS IN E.NIDULANS 2.2.1.
ANALYSE EINER CGS HOMOLOGEN CDNA AUS EMERICELLA NIDULANS 67 2.2.1.1.
UEBEREXPRESSION VON CGS* IN E.COLI 69 2.2.1.2 VERSUCHE ZUM NACHWEIS EINER
CGS-BZW. CBL-AKTIVITAET 70 DER CGS* AUS E.NIDULANS 2.2.1.3 MODIFIKATION
DER CGS- BZW. CBL-ENZYMASSAYS ZUM NACHWEIS - 72 EINER CGS*-FUNKTION 3.
DISKUSSION 77 3.1. DAS PFLANZLICHE MOEB-HOMOLOGE CNX5 77 3.2. DIE
FUNKTION VON CNX5 83 3.2.1. BEWERTUNG DER ANTISENSE-TRANSFORMATION 83
3.2.2. DIE FUNKTION VON CNX5 INNERHALB DER MOLYBDAENCOFAKTOR-BIOSYNTHESE
84 3.2.3. DER KATALYSEMECHANISMUS VON CNX5 91 3.3 NEUE EINBLICKE IN DIE
EUKARYONTISCHE MOLYBDAENCOFAKTOR-BIOSYNTHESE DURCH ANALYSE DER
PROTEINWECHSELWIRKUNGEN VON CNX5 UND CNX6 IM 99 TWO-HYBRID-SYSTEM 3.3.1.
DAS PFLANZLICHE MOAD-HOMOLOGE CNXL 99 3.3.2 CNX5 INTERAGIERT MIT EINEM
CALMODULIN-AEHNLICHEN PROTEIN 101 3.3.3 DIE INTERAKTION DER
MOLYBDAENCOFAKTOR-BIOSYNTHESE 107 MIT ANDEREN ESSENTIELLEN
STOFFWECHSELWEGEN INHALTSVERZEICHNIS 3.4 DIE FUNKTION DES CGS-AEHNLICHEN
PROTEINS AUS E.NIDULANS 111 3.4.1 DIE FUNKTION INNERHALB DER
METHIONINBIOSYNTHESE IN E.NIDULANS 111 3.4.2 ZEIGT CGS* EINEN EINFLUSS
AUF DIE MOLYBDAENCOFAKTOR-BIOSYNTHESE? 117 4. MATERIAL UND METHODEN 120
4.1. MATERIALIEN 120 4.1.1. VERWENDETE CHEMIKALIEN, ENZYME SOWIE
EINGESETZTE GERAETE 120 4.1.2. VERWENDETE ORGANISMEN-STAEMME 121 4.1.3.
VERWENDETE PLASMIDE 122 4.1.4. ANTIKOERPER 122 4.2. ARBEITSMETHODEN 123
4.2.1. TRANSFORMATIONSTECHNIKEN 123 4.2.1.1. TRANSFORMATION VON
.CO/(-STAEMMEN 123 4.2.1.2. TRANSFORMATION VON AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
124 4.2.1.3. TRANSFORMATION VON A.THALIANA DURCH IN PLANTA
VAKUUMINFILTRATION 125 4.2.1.4. TRANSFORMATION VON EMERICELLA NIDULANS
125 4.2.1.5. TRANSFORMATION VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE IM
TWO-HYBRID-SYSTEM 126 4.2.1.6. TRANSFORMATION VON PICHIA PASTORIS ZUR
UEBEREXPRESSION REKOMBINANTER 128 PROTEINE IN EINEM EUKARYONTISCHEN
SYSTEM 4.2.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN MIT DNA 129 4.2.2.1.
KLONIERUNGSMETHODEN 129 4.2.2.2. PCR-MUTAGENESE 130 4.2.2.3. RADIOAKTIVE
MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 130 4.2.2.4. SCREENEN VON PHAGENBANKEN UND
REPLIKA-HYBRIDISIERUNG 130 4.2.2.5. SOUTHERN BLOTS 131 4.2.2.6.
DNA-SEQUENZIERUNG 131 4.2.3. PROTEINBIOCHEMISCHE ARBEITEN 131 4.2.3.1
BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN 131 4.2.3.2. KONZENTRIERUNG VON
PROTEINLOESUNGEN 132 4.2.3.3. PROTEINSEQUENZIERUNG 132 4.2.3.4.
SDS-POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE(SDS-PAGE) 132 4.2.3.5. IMMUNOBLOT
133 4.2.3.6. ENTSALZEN VON PROTEINLOESUNGEN 133 INHALTSVERZEICHNIS
4.2.3.7. UEBEREXPRESSION UND AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG
HIS-GETAGGTER PROTEINE UEBER EINE NI-NTA-MATRIX 134 4.2.4. ENZYMASSAYS
4.2.4.1. BESTIMMUNG DER NITRATREDUKTASE-AKTIVITAET 4.2.4.1.1.
QUALITATIVER TEST DER NITRATREDUKTASE-AKTIVITAET IN E.COLI 4.2.4.1.2.
QUANTIFIZIERUNG DER NITRATREDUKTASE-AKTIVITAET IN PFLANZEN 4.2.4.2.
DERM R-1 REKONSTITUTIONSASSAY 4.2.4.2.1. HERSTELLUNG DES N.CRASSA NIT-L
EXTRAKTS 4.2.4.2.2. DER CONVERTING-FACTOR -ASSAY 4.2.4.3.
SULFURTRANSFERASE-ASSAYS 4.2.4.4. CGS/CBL-ASSAYS 135 135 135 135 136 136
136 138 139 S. ANHANG 140 5.1. NUKLEOTIDSEQUENZEN 5.1.1. A. THALIANA UBA
1 5.1.2. N.PLUMBAGINIFOLIA CNX5 140 140 141 5.2. ENZYMASSAYS 5.2.1.
NIT-L REKONSTITUTION 5.2.2. SULFURTRANSFERASE-ASSAYS 5.2.2.1.
THIOSULFAT-REDUKTASE-AKTIVITAET 5.2.2.2. CYSTEIN-DESULFHYDRASE-AKTIVITAET
5.2.2.3. RHODANESE-AKTIVITAET 5.2.2.4.
MERCAPTOPYRUVAT-SULFURTRANSFERASE-AKTIVITAET 5.2.3. CGS*/CBL-ASSAYS:
5.2.3.1. KM-WERT-BESTIMMUNG FUER O-SUCCINYLHOMOSERIN 5.2.3.2.
KIS-WERT-BESTIMMUNG FUER CYSTEIN 5.2.3.3. EINFLUSS VON GLUTATHION,
MOLYBDAT UND ATP AUF DIE CGS »-AKTIVITAET 142 142 142 143 143 143 143 144
144 144 145 6. LITERATUR 146
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