Einfluss von Phosphodiesterase 4 und Proteinphosphatase 1 auf die Regulation proinflammatorischer Cytokine und Stickstoffmonoxid in Lipopolysaccharid-aktivierten Makrophagen:
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Darmstadt
2005
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| adam_text | EINFLUSS VON PHOSPHODIESTERASE 4 UND PROTEINPHOSPHATASE 1 AUF DIE
REGULATION PROINFLAMMATORISCHER CYTOKINE UND STICKSTOFFMONOXID IN
LIPOPOLYSACCHARID- AKTIVIERTEN MAKROPHAGEN VOM FACHBEREICH BIOLOGIE DER
TECHNISCHEN UNIVERSITAET DARMSTADT GENEHMIGTE DISSERTATION VON DIPL.
BIOL. SIBYLLE OHLWEILER AUS MICHELSTADT-VIELBRUNN REFERENTIN: PROF. DR.
K. NIXDORFF KOREFERENTIN: PROF. DR. F. PFEIFER TAG DER EINREICHUNG: 09.
SEPTEMBER 2005 TAG DER MUENDLICHEN PRUEFUNG: 28. OKTOBER 2005 DARMSTADT
2005 X G OES D 17 BB TU DARMSTADT ULI IIIII 52546923 INHALTSVERZEICHNIS
III INHALTSVERZEICHNIS I. EINLEITUNG 1 1. DAS IMMUNSYSTEM 1 1.1. DIE
ENTWICKLUNG UND REIFUNG VON MAKROPHAGEN 2 1.2. ALLGEMEINE FUNKTIONEN VON
MAKROPHAGEN 3 2. DAS LIPOPOLYSACCHARID GRAM-NEGATIVER BAKTERIEN 3 3. DIE
LPS-INDUZIERTE AKTIVIERUNG VON MAKROPHAGEN 4 4. INTRAZELLULAERE
SIGNALKASKADEN NACH LPS-AKTIVIERUNG 7 4.1. TYROSINKINASEN 7 4.2. DIE
KLASSISCHEN MAP-KINASE-WEGE 7 4.3. INTRAZELLULAERE SIGNALTRANSDUKTION
UEBER DAS ADAPTERMOLEKUEL MYD88 8 4.4. MYD88-UNBHAENGIGE INTRAZELLULAERE
SIGNALTRANSDUKTION 10 4.5. DER CAMP-ABHAENGIGE PROTEINKINASE-A-WEG 10 5.
POTENTIELLE REGULATOREN DES PKA-WEGES 12 5.1. PHOSPHODIESTERASEN 12 5.2.
PROTEINPHOSPHATASEN 13 6. TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 14 6.1. CAMP-RESPONSE
ELEMENT-BINDINGPROTEIN (CREB) 14 6.2. NUCLEARFACTOR KB (NF-KB) 16
63.NUCLEARFACTORLL-6(NF-LL6) 17 6.4. ACTIVATORPROTEIN (AP-1) 17 6.5.
PURIM-RICH MOTIFTRANSCRIPTIONSFACTOR (PU.L). 17 7. DIE
PROINFLAMMATORISCHEN CYTOKINE 17 7.1.INTERLEUKIN-LSS(IL-LSS 18 7.1.1.
LPS-INDUZIERBARE CIS-ACTING ELEMENTE IM IL-LSS-GEN. 18 7.2. INTERLEUKIN-6
(IL-6) 20 7.3.TUMORNEKROSEFAKTORA(TNFA). 20 7.4. DIE EFFEKTE
PROINFLAMMATORISCHER CYTOKINE IN V/VO. 21 8. DIE LPS-INDUZIERTE
PRODUKTION VON STICKSTOFFMONOXID 22 8.1. DIE.REGULATION DER
INDUZIERBAREN NO-SYNTHASE 22 8.2. BIOLOGISCHE EFFEKTE VON
STICKSTOFFMONOXID 23 8.3. DER OXIDATIVE BURST 24 INHALTSVERZEICHNIS ; IV
II. PROBLEMSTELLUNG * 25 III. MATERIAL & METHODEN 27 1. CHEMIKALIEN 27
2. MILLI-Q-WASSER ; .29 3. ZELLKULTUR 29 3.1. DIE PERMANENTE ZELLLINIE
RAW 264.7 29 3.2. ALLGEMEINE METHODEN 29 3.2.1. STERILISATION DER
VERWENDETEN MATERIALIEN 29 3.2.2. BESTIMMUNG VON LEBENDZELLZAHL UND
VITALITAET 30 3.2.3. LANGZEITKONSERVIERUNG VON ZELLEN. 30 3.3. MEDIEN,
ZUSAETZE UND LOESUNGEN 31 3.3.1. DAS GRUNDMEDIUM 31 3.3.2. BESTANDTEILE
DES VOLLWERTIGEN KULTURMEDIUMS 31 3.3.3. DAS KULTURMEDIUM 32 3.4. DIE
KULTIVIERUNG DER PERMANENTEN ZELLLINIE RAW 264.7 32 3.5. EINSATZ VON
LIPOPOLYSACCHARID 33 3.6. EINSATZ VON REAGENZIEN ZUR MODULATION DER
CYTOKIN- UND NO-PRODUKTION. 33 3.6.1.
DI-BUTURYL-CYCLISCHES-3 -,5 -ADENOSINMONOPHOSPHAT 34 3.6.2. DER
PHOSPHODIESTERASE 4-INHIBITOR ROLIPRAM 34 3.6.3. DER PROTEINPHOSPHATASE
1-INHIBITOR TAUTOMYCIN 34 3.7. STIMULIERUNG UND INHIBITION DER RAW
264.7-MAKROPHAGEN. 35 3.8. MESSUNG DER CYTOTOXIZITAET MITTELS
LACTATDEHYDROGENASE-TEST 35 3.9. NACHWEIS DER CYTOKINPRODUKTION MITTELS
ENZYMGEBUNDENER IMMUNO-ASSAYS 36 3.9.1. GEWINNUNG VON UEBERSTAENDEN UND
LYSATEN 37 3.10. NACHWEIS DER PRODUKTION VON STICKSTOFFMONOXID. 38 3.11.
UNTERSUCHUNGEN ZUR AKTIVIERUNG DES TRANSKRIPTIONSFAKTORS CREB 39 3.11.1.
HERSTELLUNG DER GESAMTZELL-LYSATE 39 3.11.2. BESTIMMUNG DER
PROTEINKONZENTRATION. 39 3.11.3. ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON
PROTEINGEMISCHEN. 40 3.11.4. WESTERN-BLOT 41 3.11.5. ANTIKOERPER UND
SUBSTRAT FUER DEN EINSATZ IN DER WESTERN-ANALYSE 41 3.11.6. DURCHFUEHRUNG
DES WESTERN-BLOT 42 4. MOLEKULARBIOLOGISCHE STANDARDMETHODEN 43 4.1.
BESTIMMUNG DER KONZENTRATION VON NUKLEINSAEUREN 43 4.2.
PHENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL-EXTRAKTION VON NUKLEINSAEUREN. 44 4.3.
FAELLEN UND WASCHEN VON NUKLEINSAEUREN 44 4.4. VERMEHRUNG UND ISOLIERUNG
VON PLASMIDEN 44 INHALTSVERZEICHNIS Y 4.4.1. HERSTELLUNG
CHEMISCH-KOMPETENTER ZELLEN. 45 4.4.2. TRANSFORMATION VON E. COLI-ZEUEEN
46 4.4.3. PRAEPARATIVE ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIELLEN ZELLEN
46 4.5. ENZYMATISCHE DNA-HYDROLYSE MITTELS RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 46
4.6. NATIVE DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 46 5. NORTHERN ANALYSEN ZUM
NACHWEIS SPEZIFISCHER MRNA 46 5.1. ALLGEMEINE HINWEISE ZUM ARBEITEN MIT
RNA 47 5.2. RNA-ISOLIERUNG AUS MAKROPHAGEN 47 5.3. DENATURIERENDE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE MIT FORMALDEHYD 48 5.4. UEBERPRUEFUNG VON
ELEKTROPHORESELAUFUND QUALITAET DER AUFGETRENNTEN RNA. 49 5.5.
NORTHERN-BLOT 50 5.6. PRAEHYBRIDISIERUNG DER NYLONMEMBRAN. 50 5.7.
STRANGSPEZIFISCHE RNA-SONDEN 51 5.8. DIGOXYGENIN (DIG)-MARKIERUNG DER
RNA-SONDEN 51 5.9. HYBRIDISIERUNG DER MEMBRAN 52 5.10. DENSITOMETRISCHE
AUSWERTUNG DER NORTHERN-ANALYSE-FILME 53 6. ERMITTLUNG DER
PROMOTORAKTIVITAET. 53 6.1. PROMOTOR-REPORTERGEN-KONSTRUKTE 53 6.1.1. DER
LUCIFERASE-EXPRESSIONSVEKTOR PXT-LUC. 54 6.1.2. DER
LUCIFERASE-EXPRESSIONSVEKTOR PX2-HT-LUC 54 6.1.3. DER
LUCIFERASE-EXPRESSIONSVEKTOR PCRE-LUC 55 7. DIE TRANSFEKTION 56 7.1.
TRANSFEKTION MITTELS CALCIUMPHOSPHAT-PRAEZIPITATION 56 7.1.1.
DURCHFUEHRUNG DER TRANSFEKTION 56 7.1.2. STIMULIERUNG UND INHIBITION DER
TRANSFIZIERTEN ZELLEN 56 7.2. REPORTERGEN-ASSAY DER LUCIFERASE-AKTIVITAET
57 8. STATISTISCHE METHODEN 58 IV. ERGEBNISSE 59 1. UNTERSUCHUNGEN ZUR
REGULATION VON IL-LSS IN RAW 264.7-MAKROPHAGEN 59 1.1. EINSATZ VON
DB-CAMP ZUR MODULIERUNG DER IL-1 SS-PRODUKTION IN LPS-STIMULIERTEN RAW
264.7-MAKROPHAGEN 59 1.1.1. KONZENTRATIONSABHAENGIGER EINFLUSS VON
DB-CAMP AUFDIELL-LSS-PRODUKTION 59 INHALTSVERZEICHNIS VI 1.1.2.
ERMITTLUNG DER GEEIGNETEN DB-CAMP-KONZENTRATION 60 1.1.3. ZEITKINETISCHE
STUDIEN ZUM EINFLUSS VON DB-CAMP AUF DIE IL-LSS-PRODUKTION 61 1.1.4.
EINFLUSS VON DB-CAMP AUF DIE IL-LSS-MRNA-AKKUMULATION 62 1.2. INHIBITION
DER PHOSPHODIESTERASE 4 ZUR MODULIERUNG DER IL-LSS-PRODUKTION IN
LPS-STIMULIERTEN RAW 264.7-MAKROPHAGEN 64 1.2.1.
KONZENTRATIONSABHAENGIGER EINFLUSS VON ROLIPRAM 64 1.2.2. ERMITTLUNG DER
GEEIGNETEN ROLIPRAM-KONZENTRATION 65 1.2.3. ZEITKINETISCHE STUDIEN ZUM
EINFLUSS VON ROLIPRAM. 65 1.2.4. EINFLUSS VON ROLIPRAM AUF DIE
IL-LSS-MRNA-AKKUMULATION 66 1.2.5. EINFLUSS VON ROLIPRAM AUF DIE
VOLLSTAENDIGE HUMANE IL-1$-ENHANCER- PROMOTORREGION. 68 1.2.6. EINFLUSS
VON ROLIPRAM AUF DIE MINIMALE HUMANE IL-1$-ENHANCER- PROMOTORREGION 69
1.2.7. EINFLUSS VON ROLIPRAM AUF DIE PROMOTOR-AKTIVIERUNG IM
EXPRESSIONSVEKTOR PCRE-LUC 71 1.2.8. EINFLUSS VON ROLIPRAM AUF DIE
PHOSPHORYLIERUNG VON CREB 72 1.3. INHIBITION DER PROTEINPHOSPHATASE 1
ZUR MODULIERUNG DER IL-LSS-PRODUKTION IN LPS-STIMULIERTEN RAW
264.7-MAKROPHAGEN .73 1.3.1. ERMITTLUNG DER GEEIGNETEN
TAUTOMYCIN-KONZENTRATION 73 1.3.2. EINFLUSS VON TAUTOMYCIN AUF DIE
IL-LSS-PRODUKTION 74 1.3.3. EINFLUSS VON TAUTOMYCIN AUF DIE
IL-LSS-MRNA-AKKUMULATION 75 1.3.4. EINFLUSS VON TAUTOMYCIN AUF DIE
VOLLSTAENDIGE HUMANE IL-1 SS-ENHANCER- PROMOTOR-REGION 77 1.3.5. EINFLUSS
VON TAUTOMYCIN AUF DIE MINIMALE HUMANE IL-1$-ENHANCER- PROMOTOR-REGION
78 1.3.6. EINFLUSS VON TAUTOMYCIN AUF DIE PROMOTORAKTIVITAET IN PCRE-LUC
79 1.3.7. EINFLUSS VON TAUTOMYCIN AUF DIE PHOSPHORYLIERUNG DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORS CREB 80 2. UNTERSUCHUNGEN ZUR REGULATION VON TNFA
IN LPS-STIMULIERTEN RAW 264.7-MAKROPHAGEN 81 2.1.EINFLUSS VON CAMP AUF
DIE TNFCC-PRODUKTION 81 2.2. EINFLUSS VON ROLIPRAM AUF DIE
TNFOT-PRODUKTION 82 2.2.1. EINFLUSS VON ROLIPRAM AUF DIE
TNFA-MRNA-AKKUMULATION. 83 2.3. EINFLUSS VON TAUTOMYCIN AUF DIE
TNFA-PRODUKTION. 84 2.3.1. EINFLUSS VON TAUTOMYCIN AUF DIE
TNFA-MRNA-AKKUMULATION 85 3. UNTERSUCHUNGEN ZUR REGULATION VON IL-6 IN
LPS-STIMULIERTEN RAW 264.7-MAKROPHAGEN. 86 3.1. EINFLUSS VON DB-CAMP
AUF DIE IL-6-PRODUKTION 86 3.2. EINFLUSS VON ROLIPRAM AUF DIE
IL-6-PRODUKTION 87 INHALTSVERZEICHNIS VII 3.3. EINFLUSS VON TAUTOMYCIN
AUF IL-6-PRODUKTION. 88 4. DIE PRODUKTION VON STICKSTOFFMONOXID 89 4.1.
EINFLUSS VON DB-CAMP AUF DIE PRODUKTION VON STICKSTOFFMONOXID 89 4.2.
EINFLUSS VON ROLIPRAM AUF DIE STICKSTOFFMONOXID-PRODUKTION .90 4.3.
EINFLUSS VON TAUTOMYCIN AUF DIE PRODUKTION VON STICKSTOFFMONOXID .91 V.
DISKUSSION 93 1. DIE DIFFERENZIERTE REGULATION DER PRODUKTION DER
PROINFLAMMATORISCHEN CYTOKINE IL-LSS, TNFA UND IL-6 .93 2. KINETISCHE
STUDIEN ZUM EINFLUSS VON DB-CAMP, ROLIPRAM UND TAUTOMYCIN AUF DIE
IL-LSS-PRODUKTION IN LPS-AKTIVIERTEN RAW 264.7-MAKROPHAGEN 94 2.1.
EINFLUSS VON DB-CAMP AUF DIE REGULATION UND PRODUKTION VON IL-LSS_ 95
2.2. EINFLUSS VON ROLIPRAM AUF DIE REGULATION UND PRODUKTION VON IL-LSS
95 2.3. EINFLUSS VON TAUTOMYCIN AUF DIE REGULATION UND PRODUKTION VON
IL-LSS 96 3. PROMOTORAKTIVAETSSTUDIEN ZUM EINFLUSS VON ROLIPRAM UND
TAUTOMYCIN AUF DAS HUMANE IL-LSS-GEN 97 4. KINETISCHE STUDIEN ZUM
EINFLUSS VON DB-CAMP, ROLIPRAM UND TAUTOMYCIN AUF DIE TNFA-PRODUKTION IN
LPS-AKTIVIERTEN RAW 264.7-MAKROPHAGEN 99 4.1. EINFLUSS VON DB-CAMP AUF
DIE PRODUKTION VON TNFA. 100 4.2. EINFLUSS VON ROLIPRAM AUF DIE
REGULATION UND PRODUKTION VON TNFA 100 4.3. EINFLUSS VON TAUTOMYCIN AUF
DIE REGULATION UND PRODUKTION VON TNFA 101 5. KINETISCHE STUDIEN ZUM
EINFLUSS VON DB-CAMP, ROLIPRAM UND TAUTOMYCIN AUF DIE LPS-INDUZIERTE
PRODUKTION VON IL-6 IN RAW 264.7-MAKROPHAGEN 101 5.1. EINFLUSS VON
DB-CAMP AUF DIE PRODUKTION VON IL-6 101 5.2. EINFLUSS VON ROLIPRAM AUF
DIE PRODUKTION VON IL-6 102 5.3. EINFLUSS VON TAUTOMYCIN AUF DIE
PRODUKTION VON IL-6 102 6. ZUSAMMENFASSENDER UEBERBLICK UEBER DIE
REGULATION DER PROINFLAMMATORISCHEN CYTOKINE IL-LSS, TNFA UND IL-6 102 7.
UEBERLEGUNGEN ZUR DIFFERENZIERUNG DER SIGNALWEGE ZUR PRODUKTION VON
IL-LSS, TNFA UND IL-6 103 7.1. DIE BEDEUTUNG DER TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
CREB VS. NF-KB FUER DIE PRODUKTION PROINFLAMMATORISCHER CYTOKINE 103 8.
UNTERSUCHUNGEN ZUM EINFLUSS VON DB-CAMP, ROLIPRAM UND TAUTOMYCIN AUF DIE
LPS-INDUZIERTE PRODUKTION VON STICKSTOFFMONOXID IN RAW 264.7-
MAKROPHAGEN 105 INHALTSVERZEICHNIS VIII 9. KONTROLLEN UEBER DIE
EXPRESSION DER CYTOKINGENE DURCH TYROSINKINASEN UND TYROSINPHOSPHATASEN
IM ZUSAMMENHANG MIT DEM OXIDATIVE BURST 107 10. AUSBLICK 108 VI.
ZUSAMMENFASSUNG _ 110 ABSTRACT / ENGLISCHE UEBERSETZUNG DER
ZUSAMMENFASSUNG 112 VII. LITERATUR 114 VIII. ANHANG 129 WERTETABELLEN ZU
DEN ABBILDUNGEN 129 LEBENSLAUF 136
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