Identifizierung und Charakterisierung von SURVER, einem neuen Bindungspartner von Survivin: funktionelle Untersuchungen zur Rolle in Apoptose, Zellzyklusregulation und Mitose
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BINDUNGSPARTNER VON SURVIVIN - FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN ZUR ROLLE IN
APOPTOSE, ZELLZYKLUSREGULATION UND MITOSE DEM FACHBEREICH DER
TECHNISCHEN UNIVERSITAET DARMSTADT ZUR ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN GRADES
EINES DOKTOR RERUM NATURALIUM EINGEREICHTE DISSERTATION VON JOERG VON
HAGEN AUS DIEMELSEE-HERINGHAUSEN UNIVERSITAETS- UND LARSCTES- BIBLIOTHAK
DARRNSTADT BIBTIOTHEK BIOLOGIE TAG DER EINREICHUNG 07. MAI 2004 FCW.-NR
ERSTBERICHTERSTATTER ZWEITBERICHTERSTATTER DRITTBERICHTERSTATTER PROF.
DR. THOMAS HOLSTEIN PROF. DR. PAUL LAYER PD DR. MATTHIAS GRELL DARMSTADT
2004 BB TU DARMSTADT ULI III 52504783 INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS V TABELLENVERZEICHNIS VIII ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
IX 1. EINLEITUNG 1 1.1. MOLEKULARE GRUNDLAGEN DER APOPTOSE 1 1.1.1.
REZEPTORVERMITTELTE APOPTOSE 2 1.1.2. MITOCHONDRIALVERMITTELTE APOPTOSE
3 1.2. DIE INHIBITOREN DER APOPTOSE (LAP S) - INHIBIERUNG VON CASPASEN 5
1.2.1. DIE ROLLE DER LAP S IN DER REZEPTORVERMITTELTEN APOPTOSE 6 1.2.2.
DIE ROLLE DER LAP S IN DER MITOCHONDRIALVERMITTELTEN APOPTOSE 8 1.2.3.
DIE ROLLE DER LAP S IN DER DNA-SCHADENVERMITTELTEN APOPTOSE 8 1.3.
SURVIVIN 9 1.4. SURVIVIN-BINDENDE PROTEINE 12 1.4.1. SURVIVIN-BINDENDE
PROTEINE IM KONTEXT VON APOPTOSE 12 1.4.2. SURVIVIN-BINDENDE PROTEINE IM
KONTEXT DER ZELLZYKLUSREGULATION 13 1.4.3. SURVIVIN-BINDENDE PROTEINE IM
KONTEXT DES CHROMOSOMAL-PASSENGERCOMPLEX 14 1.5. INTERAKTION VON
SURVER MIT SURVIVIN 17 2. FRAGESTELLUNG 19 3. MATERIAL UND METHODEN 20
3.1. MATERIAL 20 3.1.1. GERAETE 20 3.1.2. SOFTWARE 21 3.1.3.
VERBRAUCHSMATERIAL 21 3.1.4. CHEMIKALIEN / REAGENZIEN 22 3.1.5. ENZYME :
23 3.1.6. ANTIKOERPER 24 3.1.7. KITS 25 3.1.8. VEKTOREN 25 3.1.9. DNA-UND
PROTEIN-GROESSENSTANDARDS 26 3.1.10. MRNA UND CDNA FUER DIE ECHTZEIT-PCR IM
TAQMAN UND LIGHTCYCLER SYSTEM 26 3.1.11. BAKTERIEN- UND HEFESTAEMME 27
3.1.12. HUMANE ZELLLINIE 27 3.1.13. MEDIEN UND LOESUNGEN 28 3.2. METHODEN
34 3.2.1. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN UND DNA-STANDARDPROZEDUREN 34
3.2.2. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 34 3.2.3. QUANTIFIZIERUNG VON
NUKLEINSAEUREN 34 3.2.4. ISOLATION VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN 35
3.2.5. ELUTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 35 3.2.6. A-TAILING A
M 3 OH-ENDE VON ZU MONIERENDER DNA 36 3.2.7. TA-KLONIERUNG IN DEN
ZIELVEKTOR 36 3.2.8. RNA 36 3.2.8.1. ISOLIERUNG VON RNA AUS
EUKARYONTISCHEN ZELLEN 37 3.2.8.2. REVERSE TRANSKRIPTION ZUR
CDNA-SYNTHESE {RT-PCR) 37 3.2.8.3. NORTHERN-BLOT-ANA YSE 37 3.2.9.
POLYMERASE-KETTENREAKTION- (PCR) UND ECHTZEIT-PCR-TECHNIKEN 38 3.2.9.1.
POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 38 3.2.9.2. AUTOMATISIERTE
FLUORESZENZ-SEQUENZIERUNG 41 3.2.9.3. ECHTZEIT-PCR-ANALYSE 42.
3.2.9.3.1. TAQMAN-ANALYSE 42 3.2.9.3.2. L/GWCYE/ER-ANALYSE 44 3.2.9.3.3.
RELATIVE QUANTIFIZIERUNG DER ECHTZEIT-PCR 46 I INHALTSVERZEICHNIS
3.2.10. ZELLKULTURTECHNIK 48 3.2.10.1. PROKARYONTISCHE ZELLKULTUR 48
3.2.10.1.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN 48 3.2.10.1.2.
TRANSFORMATION VON BAKTERIENZELLEN 48 3.2.10.2. EUKARYONTISCHE
ZELLKULTURTECHNIK 49 3.2.10.2.1. EUKARYONTISCHE ZELLKULTURBEDINGUNGEN 49
3.2.10.2.2. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 49 3.2.10.2.3. LAGERUNG
EUKARYONTISCHER ZELLEN 49 3.2.10.2.4. TRANSIENTE DNA-TRANSFEKTION VON
EUKARYONTISCHEN ZELLEN MITTELS EFFECTENE* 50 3.2.10.2.5. TRANSIENTE
SIRNA-TRANSFEKTION VON HELA-ZELLEN MITTELS LIPOFECTAMINE 2000* 50
3.2.10.3. SS-GALAKTOSIDASE-TEST 51 3.2.10.4. APOPTOSEINDUKTIONSVERFAHREN
52 3.2.11. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN UND REKOMBINANTE
SURVER-EXPRESSION 53 3.2.11.1. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION
MITTELS BCA-TESX 53 3.2.11.2. BACULOVIRUSEXPRESSION VON SURVER IN SF
9-ZELLEN 53 3.2.11.3. PROTEINEXTRAKTION AUS DER ZELLMASSE DER
BACULOVIRUSEXPRESSION 54 3.2.11.4. METALLCHELATCHROMATOGRAFIE 54
3.2.11.5. DIALYSE VON REKOMBINANTEM SURVER 54 3.2.11.6.
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAFIE 54 3.2.11.7. NATRIUMDODECYLSULFAT
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE.(SDS-PAGE) 55 3.2.11.8. COOMASSIEFAERBUNG
DER SDS-POLYACRYLAMIDGELE 55 3.2.11.9. TRANSFERVON PROTEINEN DURCH
ELEKTROB/OTF/NGR 55 3.2.12. METHODEN ZUR
PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONSANALYSE 56 3.2.12.1. PFTAGE-D/SP/AY-SYSTEM
56 3.2.12.2. IMMUNPRAEZIPITATION (PULL-DOWN ASSAY) 57 3.2.12.3.
YEAST-TWO-HYBRID-ANA YSE 59 3.2.13. PROTEIN-LOKALISATIONMETHODEN 60
3.2.13.1. DIFFERENTIELLE FRAKTIONIERUNG VON PROTEINEN MIT DETERGENZIEN
60 3.2.13.2. MIKROTUBULI-BINDUNGSTEST MITTELS MICROTUBULE BINDING
PROTEIN ASSAY KIT. 61 3.2.13.3. IMMUNHISTOCHEMIE 61 3.2.13.4.
FLUORESZENZMIKROSKOPIE 62 4. ERGEBNISSE 65 4.1. UNTERSUCHUNGEN ZUR
GEWEBEVERTEILUNG VON SURVER 65 4.1.1. MRNA-EXPRESSIONSANALYSE VON SURVER
65 4.1.1.1. EXPRESSIONSANALYSE VON SURVER MITTELS NORTHERN-BLOT. 65
4.1.1.2. EXPRESSIONSANLYSE VON SURVER IN HUMANEN, ADULTEN GEWEBEN
MITTELS ECHTZEIT-PCF? 65 4.1.1.3. EXPRESSIONSANALYSE VON SURVER IN
TUMORZELLLINIEN 66 4.1.2. ANALYSE DER PROTEINEXPRESSION VON SURVER
MITTELS IMMUNHISTOCHEMIE 67 4.1.2.1. GENERIERUNG EINES SURVER
SPEZIFISCHEN ANTIKOERPERS 67 4.1.2.2. MIKROSKOPISCHE
SURVER-EXPRESSIONSANALYSE IN TUMORZELLLINIEN 68 4.1.2.3. SURVER- UND
SURVIVIN-PROTEINEXPRESSION IN TUMORZELLLINIEN 69 4.1.2.4.
SURVER-EXPRESSION UND LOKALISATION IN NORMAL- UND TUMORGEWEBEN 70 4.2.
SURVER INTERAGIERT MIT SURVIVIN 75 4.3. SURVER WEIST BIOINFORMATORISCH
SCHWACHE HOMOLOGIEN ZU BESCHRIEBENEN PROTEINEN AUF. 76 4.3.1. SURVER
ZEIGT SCHWACHE HOMOLOGIEN ZUR FAMILIE DER RHO-GTPASEN 77 4.3.2. SURVER
ZEIGT SCHWACHE HOMOLOGIE ZUR SEC14P-DOMAENE 78 4.4. SURVER INTERAGIERT
MIT WEITEREN FAMILIENMITGLIEDERN DER HUMANEN INHIBITOREN DER APOPTOSE
(IAP) UND APOPTOSEASSOZIIERTEN PROTEINEN 79 4.4.1. SURVER INTERAGIERT
MIT WEITEREN MITGLIEDERN DER LAP-FAMILIE IN RETIKULOZYTENLY SAETEN -. 79
4.4.2. SURVER INTERAGIERT MIT WEITEREN APOPTOSEASSOZIIERTEN ENDOGENEN
PROTEINEN. 80 4.5. SURVER IST KEIN SUBSTRAT VON CASPASEN 81 4.6. ANALYSE
DER FUNKTION VON SURVER IN APOPTOSEINDUZIERTEN HELA-ZELLEN 82 4.6.1.
SURVER SCHUETZT VOR EXTRINSISCH INDUZIERTER APOPTOSE MITTELS TRAIL 82
4.6.2. SURVER SCHUETZT VOR INTRINSISCH INDUZIERTER APOPTOSE 86 II
INHALTSVERZEICHNIS 4.6.2.1. SURVER SCHUETZT VOR UV-INDUZIERTER APOPTOSE
87 4.6.2.2. SURVER SCHUETZT VOR CAMPTOTHECIN-INDUZIERTER APOPTOSE 88
4.6.3. EFFEKT VON SURVER-SIRNA UND -SHRNA AUF DIVERSE APOPTOTISCHE
STIMULI 89 4.6.3.1. ECHTZEIT-PCR-ANALYSE ZUR BESTIMMUNG DER
SURVER-MRNA-DEGRADATION 89 4.6.3.2. BLOCKIERUNG DER
SURVER-UEBEREXPRESSION 90 4.6.3.3. EFFEKT VON SURVER-SIRNA AUF
TRAIL-INDUZIERTE APOPTOSE IN HELA-ZELLEN 91 4.6.4. EFFEKT VON
SURVER-SIRNA AUF UV-INDUZIERTE APOPTOSE IN HELA-ZELLEN 93 4.7.
SURVER-UEBEREXPRESSION FUEHRT ZUR TRANSKRIPTIONELLEN VERSTAERKUNG DER
LAP-EXPRESSION OHNE AKTIVIERUNG VON NFKB ODER DER PHOSPHORYLIERUNG VON
CDC2 93 4.7.1. SURVER-EXPRESSIONSRATE ZEIGT EINE AKTIVIERUNG DER LAP S
AUF MRNA- EXPRESSIONSEBENE 94 4.7.2. SURVER-EXPRESSIONSRATE AKTIVIERT
DIE LAP-EXPRESSION UND ZEIGT KEINE MODULATION VON NFKB UND CDC2 AUF
PROTEINEBENE 95 4.8. IDENTIFIZIERUNG DER BINDUNGSREGION VON SURVER AN
SURVIVIN UND XIAP 96 4.8.1. CHARAKTERISIERUNG DER SURVER-SURVIVIN
INTERAKTIONSREGION 97 4.8.2. CHARAKTERISIERUNG DER
SURVER-XIAP-INTERAKTIONSDOMAENE 100 4.8.3. IDENTIFIZIERUNG VON
SURVER-BINDENDEN SURVIVIN-MAUS-ISOFORMEN 101 4.8.4. SURVER INTERAGIERT
NICHT MIT DER FUNKTIONEILEN BIR-DOMAENE VON SURVIVIN 102 4.9.
PROTEINEXPRESSION UND PROTEINAUFREINIGUNG VON REKOMBINANTEM SURVER 103
4.9.1. PROTEINAUFREINIGUNG VON REKOMBINANTEM SURVER-HISTIDIN
FUSIONSPROTEIN MITTELS METALLCHELATCHROMATOGRAFIE 103 4.9.2.
PROTEINAUFREINIGUNG VON REKOMBINANTEM SURVER MITTELS
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAFIE 103 4.10. IDENTIFIZIERUNG VON SURVER
SPEZIFISCH BINDENDEN PEPTIDSEQUENZEN MITTELS *PHAGE-DISPLAY (PH.D.)
SYSTEM 106 4.11. IDENTIFIZIERUNG VON SURVER-INTERAKTIONSPARTNERN IM
HEFEBASIERENDEN PROTEIN-IHTERAKTIONSMODELL (YEAST-TWO-HYBRID SYSTEM) 112
4.11.1. SURVER INTERAGIERT MIT LAPSERI IM RETIKULOZYTENLYSAT 113 4.11.2.
CHARAKTERISIERUNG DER SURVER-LAPSERI-INTERAKTIONSDOMAENE 114 4.12.
DEPHOSPHORYLIERUNG VON CDC2 DURCH SURVER-UEBEREXPRESSION IN ABHAENGIGKEIT
DER UV-INDUZIERTEN APOPTOSE 117 4.13. LOKALISATION VON ENDOGENEM SURVER
118 4.13.1. LOKALISATION VON SURVER IN FRAKTIONIERTEN HELA-ZELLEN 118
4.13.2. DETEKTION VON SURVER IN MIKROTUBULI-ASSOZIIERTER PROTEINFRAKTION
119 4.13.3. INTERAKTION VON REKOMBINANTEM SURVER MIT MIKROTUBULI IM
MIKROTUBULI-BINDUNGSTEST 119 4.13.4. LOKALISATION VON ENDOGENEM SURVER
MITTELS FLUORESZENZMIKROSKOPIE 120 4.13.4.1. KOLOKALISATION VON SURVER
UND DER DNA IN DER META-, ANA- UND TELOPHASE DER MITOSE 122 4.13.4.2.
KOLOKALISATION VON SURVER UND SURVIVIN IN DER METAPHASE 124 4.13.4.3.
KOLOKALISATION VON SURVER UND AURORA B 125 5. DISKUSSION 129 5.1.
CHARAKTERISIERUNG DER SURVER-INTERAKTIONEN 129 5.2. EXPRESSIONSANALYSE
VON SURVER 130 5.3. SURVER IN DER APOPTOSE 133 5.4. SURVER IN DER
ZELLZYKLUSREGULATION 134 5.4.1. WIRKUNG VON SURVER AUF CDC2 BZW. AM G 2
/M-KONTROLLPUNKT 134 5.4.2. SURVER IM CHROMOSOMAL PASSENGER COMPLEX I
N DER MITOSE 136 6. ZUSAMMENFASSUNG 137 7. LITERATURVERZEICHNIS 138 III
INHALTSVERZEICHNIS 8. ANHANG 153 8.1. DAB-FAERBEPROTOKOLL DER HUMANEN
GEWEBEARRAYS AM D/ SCOVERY-FAERBEAUTOMAT....: 153 8.2. ZUSAMMENSTELLUNG
DES TUMORZELLLINIEN-ZARRAY 155 8.3. PATHOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER
GEWEBEPROBEN DES HUMANEN GEWEBEA/RAYS 155 8.4. SURVER-CDNA UND
PROTEINSEQUENZ 159 8.5. EINZELEXPERIMENTE DER APOPTOSEINDUKTION NACH
TRAIL-BEHANDLUNG 161 8.6. EINZELEXPERIMENTE DER APOPTOSEINDUKTION NACH
UV-BEHANDLUNG 163 8.7. EINZELEXPERIMENTE DER APOPTOSEINDUKTION NACH
CAMPTOTHECIN-BEHANDLUNG 165 8.8. ROENTGENKRISTALLSTRUKTUR DES
SURVIVIN-MONOMERMOLEKUELS 167 8.9. ROENTGENKRISTALLSTRUKTUR DES
SURVIVIN-DIMERMOLEKUELS 167 9. LEBENSLAUF 168 10. EIDESSTATTLICHE
ERKLAERUNG 169 IV
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| spelling | Hagen, Jörg von 1969- Verfasser (DE-588)129386715 aut Identifizierung und Charakterisierung von SURVER, einem neuen Bindungspartner von Survivin funktionelle Untersuchungen zur Rolle in Apoptose, Zellzyklusregulation und Mitose von Jörg von Hagen 2004 XIV, 169 S. Ill., graph. Darst. 21 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Darmstadt, Techn. Univ., Diss., 2004 Signaltransduktion (DE-588)4318717-1 gnd rswk-swf Inhibitorproteine (DE-588)4130448-2 gnd rswk-swf Apoptosis (DE-588)4291096-1 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Apoptosis (DE-588)4291096-1 s Inhibitorproteine (DE-588)4130448-2 s Signaltransduktion (DE-588)4318717-1 s DE-604 HEBIS Datenaustausch Darmstadt application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=017442564&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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