Rolle der GTPase ARFRP1 für die Golgi-Funktion und die Differenzierung epithelialer Zellen des Darms:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2007
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | V, 121 S. Ill., graph. Darst. 30 cm |
Internformat
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1 Zusammenfassung/Abstract 1
2 Einleitung 4
2.1 Bedeutung und Funktion monomerer GTPasen 4
2.2 Die ARF-Familie der Ras-homologen GTPasen 7
2.3 ARFRP1, ein entferntes Mitglied der ARF-Familie 11
2.4 Cadherin-vermittelte Zelladhäsion 12
2.4.1 Regulation der Cadherin-abhängigen Adhäsion 15
2.5 Der Intestinaltrakt als Modellsystem für Adhäsions-abhängige Prozesse 16
2.5.1 Übersicht zur Morphologie und Entwicklung des Darms 16
2.6 Funktionsanalyse mittels in vitro- und in wVo-Geninaktivierung 19
2.6.1 Gen-Knockdown durch RNA-Interferenz 19
2.6.2 Konditionale Geninaktivierung in der Maus mit Hilfe des Cre/loxP-
Rekombinationssystems 20
2.6.3 Durch Gen-Knockout untersuchte monomere GTPasen 22
2.7 Zielsetzung 23
3 Material und Methoden 24
3.1 Material 24
3.1.1 Medien, Puffer, Lösungen 24
3.1.2 Bakterienstämme 24
3.1.3 Verwendete Plasmidvektoren und Expressionskonstrukte 24
3.1.3.1.Plasmidvektoren 24
3.1.3.2. Expressionskonstrukte 24
3.1.4 Synthetische Oligonukleotide 25
3.1.5 Antikörper 25
3.1.6 Reaktionskits 26
3.2 Methoden 27
3.2.1 Molekularbiologische Methoden 27
3.2.1.1. Kultivierung von Eschehchia coli 27
3.2.1.2. Herstellung Calcium-kompetenter E. co//-Bakterien 27
3.2.1.3. Hitzeschock-Transformation von E. coli 28
3.2.1.4 Hydrolytische Spaltung von DNA mit Hilfe von
Restriktionsendonukleasen 28
3.2.1.5 DNA-Ligation 29
3.2.1.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 29
3.2.1.7 Direkte Klonierung von PCR-Amplifikaten 30
I
3.2.1.8 Sequenzanalyse von DNA 30
3.2.1.9. DNA-Isolation 31
3.2.1.9.1 Isolierung von Plasmid-DNA 31
3.2.1.9.2 DNA-Isolation aus Mausschwanz-Biopsie 31
3.2.1.10. RNA-Isolation 31
3.2.1.10.1 RNA-Isolation aus murinen Geweben 31
3.2.1.10.2 RNA-Isolation aus Zellkultur 32
3.2.1.10.3 Isolierung von mRNAaus Gesamt-RNA 32
3.2.1.11 Auftrennung von Nukleinsäuren durch Agarosegelelektrophorese 32
3.2.1.11.1 Agarosegelelektrophorese von DNA 32
3.2.1.11.2 Agarosegelelektrophorese von RNA 33
3.2.1.12 Northem-Blot 33
3.2.1.13 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten 34
3.2.1.14 Hybridisierung filtergebundener Nukleinsäuren 34
3.2.1.15 cDNA-Synthese 35
3.2.1.16 Arfrp7-RT-PCR 36
3.2.1.17 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) 36
3.2.1.18 Verminderung der Genexpression mittels Vektor-basierter
RNA-Interferenz 37
3.2.1.18.1 Annealing der 64 nt-Oligomere 37
3.2.1.18.2 Phosphorylierung der angelagerten Oligonukleotide 38
3.2.1.18.3 Linearisierung des pSUPER.basic-Vektors 38
3.2.1.18.4 Dephosphorylierung des pSUPER.basic-Vektors 38
3.2.1.18.5 Ligation der 64 bp Oligonukleotide mit dem
pSUPER.basic-Vektor 39
3.2.1.18.6 Selektion positiver Klone 39
3.2.1.19 Hemmung der ARFRP1-Expression mittels siRNA-Oligonukleotiden ..39
3.2.2 Zellbiologische Methoden 40
3.2.2.1 Kultivierung der Zelllinien 40
3.2.2.2 Transiente Transfektion von Zellen 40
3.2.2.3 Adhäsions-/ ssay 40
3.2.3 Analytische Methoden 41
3.2.3.1 Herstellung von Zelllysaten 41
3.2.3.2 Isolation von Proteinen aus murinen Geweben 41
3.2.3.3 Proteingehaltsbestimmung 41
3.2.3.4 Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese 41
II
3.2.3.5 Transfer elektrophoretisch aufgetrennter Proteine auf Nitrozellulose-
membranen 43
3.2.3.6 Wesfem-ß/of-Analyse 43
3.2.3.7 Immunopräzipitation 43
3.2.3.8 Indirekte Immunzytochemie und konfokale Laser-Scanning-
Mikroskopie 44
3.2.3.9 Histologie und indirekte Immunhistochemie 44
3.2.3.9.1 Paraformaldehyd-Fixierung und Gewebeeinbettung 44
3.2.3.9.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) 45
3.2.3.9.3 Perjodsäure-Schiff (PAS)-Färbung 46
3.2.3.9.4 Indirekte Immunhistochemie 46
3.2.3.9.5 Mikroskopie 47
3.2.3.9.6 Immunhistochemische Analyse der subzellulären Verteilung von
E-Cadherin 47
3.2.4 Konditionale Inaktivierung des Arfrp1-Ger s in der Maus 47
3.2.4.1 Klonierung des / rf/p7flox-Zielvektors 48
3.2.4.2 Kultivierung embryonaler Stammzellen 49
3.2.4.3 Homologe Rekombination in ES-Zellen 49
3.2.4.4 PCR-Analyse von ES-Zellklonen auf homologe Rekombination 50
3.2.4.4.1 PCR-Nachweis der ersten loxP-s/te in ES-Zellklonen nach
homologer Rekombination 51
3.2.4.5 Nachweis der einmaligen Rekombination des Targef/ng-Konstrukts 51
3.2.4.6 Transiente Cre-Expression in homolog rekombinierten ES-
Zellklonen 51
3.2.4.7 Nachweis verschiedener Cre-vermittelter Rekombinationsereignisse.... 52
3.2.4.8 Analyse der Chimären auf Keimbahngängigkeit 52
3.2.4.9 Zucht der Darm-spezifischen Arfrpi-Knockout-Maus und
Genotypisierung 53
3.2.4.9.1 Verpaarungsstrategie 53
3.2.4.9.2 Haltungsbedingungen 53
3.2.4.9.3 Genotypisierung der Versuchstiere 53
4 Ergebnisse 55
4.1 Die Rolle von ARFRP1 für die Golgi-Rekrutierung von Proteinen 55
4.1.1 ARFRP1-GTP ko-lokalisiert mit ARL1 am frans-Golgi-Kompartiment 55
4.1.2 Inaktives ARFRP1 inhibiert die Golgi-Assoziation von Golgin-245 56
4.1.3 Hemmung der ARFRP1-Expression mittels RNA-Interferenz 57
4.1.4 Knockdown von ARFRP1 in HeLa-Zellen führte zu einer Dissoziation
III
von ARL1 vom Golgi-Apparat 58
4.1.5 Hemmung der ARFRP1-Expression verhindert die ARL1 -abhängige
Rekrutierung von Golgin-245 an den Golgi-Apparat 59
4.1.6 Die Struktur des c/s-Golgi ist in Abwesenheit von ARFRP1 nicht verändert
62
4.2 Die Rolle von ARFRP1 für das Targeting von Adhäsionsproteinen 64
4.2.1 ARFRP1 ist für das Targeting von E-Cadherin an die Plasmamembran
essentiell 64
4.2.2 Das ARFRP1-regulierte Targeting von E-Cadherin ist unabhängig von
der Golgi-Assoziation von ARL1 68
4.2.3 Die Abwesenheit von E-Cadherin an der Zelloberfläche nach
Hemmung der ARFRP1-Expression ist nicht auf eine verstärkte
endozytotische Internalisierung zurückzuführen 69
4.2.4 ARFRP1 ist in einem Komplex mit E-Cadherin, ß-Catenin, a-Catenin
und p^O* assoziiert 70
4.2.5 ARFRPI-Knoc/ccfown-Zellen zeigten eine reduzierte E-Cadherin-
vermittelte Zeil-Adhäsion 72
4.3 Konditionelle Mutagenese des Arfrp1-Gens 75
4.3.1 Herstellung des / A/Äp7-7arge#ngr-Konstrukts 75
4.3.2 Homologe Rekombination des Zielvektors in das Genom embryonaler
Stammzellen 75
4.3.3 Nachweis der homologen Rekombination 76
4.3.4 Nachweis der ersten loxP-Erkennungsstelle 77
4.3.5 Analyse der einmaligen Integration des Konstrukts in das
ES-Zellgenom 79
4.3.6 Nachweis der Deletionsereignisse nach Expression der Cre-
Rekombinase 80
4.3.7 Gewinnung chimärer Mäuse und Nachweis der Keimbahn-
transmission 81
4.3.8 Zucht und Genotypisierung der Arfrp1vl]~ ~-Maus 82
4.4 Phänotypische Charakterisierung der Darm-spezifischen Arfrpi-
Knoc/couf-Maus 82
4.4.1 Nachweis der Arfrpi-Deletion mittels RT-PCR und Westem-Blot-
Analyse 83
4.4.2 Die Darm-spezifische Deletion von Arfrpi resultierte in einer
Wachstumsretardierung der Mäuse 84
4.4.3 Histopathologische Defekte im Intestinaltrakt von Arfrpfvil/ -Mäusen 85
IV
4.4.4 / r//p7vll/ -Mäuse wiesen eine abnormale Differenzierung von
Becher- und Paneth-Zellen auf 85
4.4.5 Verlust von ARFRP1 im Dünndarm führte zu einer erhöhten Zeil-
proliferation und Extension des Krypten-Kompartiments 89
4.4.6 Charakterisierung der subzellulären Lokalisation von E-Cadherin
n der Arfrpfiy -Maus 90
5 Diskussion 93
5.1 ARFRP1 reguliert die ARL1-abhängige Golgi-Rekrutierung des GRIP-
Domäne-Proteins Golgin-245 93
5.2 ARFRP1 ist für das Targeting von E-Cadherin an die Zelloberfläche und
die E-Cadherin-vermittelte Adhäsion essentiell 96
5.3 Die Funktion von ARFRP1 für die Differenzierung des Darmepithels 101
6 Literaturverzeichnis 109
7 ANHANG
7.1 Abkürzungsverzeichnis
7.2 Abbildungsverzeichnis
V
7.2 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Regulation des Aktivitätszustands monomerer GTPasen 5
Abb. 2: Übersicht über die Funktion und Lokalisation von Mitgliedern der Ras-
Superfamilie 9
Abb. 3: Vereinfachte Darstellung der Cadherin-abhängigen interzellulären Adhäsion.
14
Abb. 4: Schematische Darstellung des Wnt-Signaltransduktionswegs 15
Abb. 5: Gewebearchitektur und Zelltypzusammensetzung des adulten
Dünndarmepithels 18
Abb. 6: Mutagenese des Arfrpi-Z e vekiors zur konditioneilen Inaktivierung des
Arfrp1-Gens 48
Abb. 7: ARFRP1-GFP beeinflusst die subzelluläre Lokalisation von endogenem
ARL1 in HeLa-Zellen 55
Abb. 8: Subzelluläre Lokalisation von Golgin-245 (A, B) nach Expression von
konstitutiv aktivem oder inaktivem ARL1 (A) und konstitutiv aktivem oder
inaktivem ARFRP1 (B) in HeLa-Zellen 57
Abb. 9: Hemmung der ARFRP1-GFP-Expression (A) und der endogenen ARFRP1-
Expression (B) mittels RNA-Interferenz in COS-7- (A) und HeLa-Zellen (B)....
58
Abb. 10: Subzelluläre Lokalisation von ARL1 nach Hemmung der ARFRP1-
Expression in HeLa-Zellen 59
Abb. 11: Knockdown der ARFRP1-Expression in HeLa-Zellen zerstörte die Golgi-
Assoziation von ARL1-Q71L (A), endogenem ARL1 (B) und des ARL1-
Effektors Golgin-245 (A, B) 61
Abb. 12: Die Hemmung der ARFRP1-Expression ändert nicht die Golgi-Verteilung
der Golgi-Matrix-Proteine GM130 und Giantin 63
Abb. 13: Depletion der ARFRP1-Expression in HeLa-Zellen ändert die Struktur des
TGN und die Verteilung von Syntaxin-6 64
Abb. 14: Inhibierung der ARFRP1-Expression in HeLa-Zellen beeinträchtigt das
Targeting von E-Cadherin an die Zelloberfläche 65
Abb. 15: Inhibierung der ARFRP1-Expression in HeLa-Zellen beeinträchtigt nicht die
Lokalisation von N-Cadherin oder ß-Catenin an der Plasmamembran 66
Abb. 16: Effekt der ARFRP1-Depletion auf die Expression von E-Cadherin, N-
Cadherin und a-Tubulin in HeLa-Zellen 67
Abb. 17: Das ARFRP1-regulierte Targeting von E-Cadherin ist unabhängig von der
Golgi-Lokalisation von ARL1 68
Abb. 18: Eine reduzierte Zelloberflächenlokalisation von E-Cadherin in ARFRP1-
depletierten Zellen ist keine Folge einer verstärkten endozytotischen
Intemalisierung von E-Cadherin 70
Abb. 19: ARFRP1 ko-immunopräzipitiert mit Bestandteilen des E-Cadherin-Catenin-
Komplexes 71
Abb. 20: Depletion von ARFRP1 führte zu verminderter Zeil-Adhäsion 73
Abb. 21: Schematische Darstellung der homologen Rekombination des Arfrpi 0 -
Targeting-Vektors in den/ /fApt-Locus 76
Abb. 22: PCR-basierte Analyse auf homologe Rekombination des Targeting-Vektors
in das ES-Zellgenom 77
Abb. 23: PCR-Nachweis der ersten loxP-s/te 78
Abb. 24: Nachweis des einmaligen Rekombinationsereignisses in den ES-Zellklonen
17, 59 und 243 79
Abb. 25: Schematische Darstellung des PCR-Nachweises der Rekombinations¬
ereignisse nach transienter Cre-Rekombinase-Transfektion 80
Abb. 26: PCR-basierter Nachweis der Cre-vermittelten Rekombinationsereignisse.81
Abb. 27: Genotypisierung dery4/f/p7vil/~-Mäuse 82
Abb. 28: Selektive Deletion des Arfrp7-Gens im Intestinaltrakt 84
Abb. 29: Postnatale Wachstumsretardierung von Arfrp 7vll/ -Mäusen 85
Abb. 30: Arfrpfvll / - Mäuse zeigen eine massive Reduktion reifer Becherzellen 87
Abb. 31: Deletion von Arfrpi im Colon beeinträchtigt die Differenzierung von Becher-
Zellen, jedoch nicht die Bildung von enteroendokrinen Zellen 88
Abb. 32: Arfrp 1 ^ -Mäuse wiesen eine gestörte Differenzierung von Paneth-Zellen
auf 89
Abb. 33: Kryptenhyperplasie und verstärkte Ki67-Färbung in Arfrp 1 vll/ -Mäusen 90
Abb. 34: Veränderte E-Cadherin-Verteilung in den Krypten der/lAf/p7v l / -Mäuse....91
Abb. 35: Lokalisation von E-Cadherin im Villusepithel der Darm-spezifischen Arfrpi-
Nullmutante 92
Abb. 36:Modell für die Rolle von ARFRP1 am frans-Golgi-Netzwerk und für das E-
Cadherin-Targeting zur Plasmamembran 98
|
| adam_txt |
INHALTSVERZEICHNIS
1 Zusammenfassung/Abstract 1
2 Einleitung 4
2.1 Bedeutung und Funktion monomerer GTPasen 4
2.2 Die ARF-Familie der Ras-homologen GTPasen 7
2.3 ARFRP1, ein entferntes Mitglied der ARF-Familie 11
2.4 Cadherin-vermittelte Zelladhäsion 12
2.4.1 Regulation der Cadherin-abhängigen Adhäsion 15
2.5 Der Intestinaltrakt als Modellsystem für Adhäsions-abhängige Prozesse 16
2.5.1 Übersicht zur Morphologie und Entwicklung des Darms 16
2.6 Funktionsanalyse mittels in vitro- und in wVo-Geninaktivierung 19
2.6.1 Gen-Knockdown durch RNA-Interferenz 19
2.6.2 Konditionale Geninaktivierung in der Maus mit Hilfe des Cre/loxP-
Rekombinationssystems 20
2.6.3 Durch Gen-Knockout untersuchte monomere GTPasen 22
2.7 Zielsetzung 23
3 Material und Methoden 24
3.1 Material 24
3.1.1 Medien, Puffer, Lösungen 24
3.1.2 Bakterienstämme 24
3.1.3 Verwendete Plasmidvektoren und Expressionskonstrukte 24
3.1.3.1.Plasmidvektoren 24
3.1.3.2. Expressionskonstrukte 24
3.1.4 Synthetische Oligonukleotide 25
3.1.5 Antikörper 25
3.1.6 Reaktionskits 26
3.2 Methoden 27
3.2.1 Molekularbiologische Methoden 27
3.2.1.1. Kultivierung von Eschehchia coli 27
3.2.1.2. Herstellung Calcium-kompetenter E. co//-Bakterien 27
3.2.1.3. Hitzeschock-Transformation von E. coli 28
3.2.1.4 Hydrolytische Spaltung von DNA mit Hilfe von
Restriktionsendonukleasen 28
3.2.1.5 DNA-Ligation 29
3.2.1.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 29
3.2.1.7 Direkte Klonierung von PCR-Amplifikaten 30
I
3.2.1.8 Sequenzanalyse von DNA 30
3.2.1.9. DNA-Isolation 31
3.2.1.9.1 Isolierung von Plasmid-DNA 31
3.2.1.9.2 DNA-Isolation aus Mausschwanz-Biopsie 31
3.2.1.10. RNA-Isolation 31
3.2.1.10.1 RNA-Isolation aus murinen Geweben 31
3.2.1.10.2 RNA-Isolation aus Zellkultur 32
3.2.1.10.3 Isolierung von mRNAaus Gesamt-RNA 32
3.2.1.11 Auftrennung von Nukleinsäuren durch Agarosegelelektrophorese 32
3.2.1.11.1 Agarosegelelektrophorese von DNA 32
3.2.1.11.2 Agarosegelelektrophorese von RNA 33
3.2.1.12 Northem-Blot 33
3.2.1.13 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten 34
3.2.1.14 Hybridisierung filtergebundener Nukleinsäuren 34
3.2.1.15 cDNA-Synthese 35
3.2.1.16 Arfrp7-RT-PCR 36
3.2.1.17 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) 36
3.2.1.18 Verminderung der Genexpression mittels Vektor-basierter
RNA-Interferenz 37
3.2.1.18.1 Annealing der 64 nt-Oligomere 37
3.2.1.18.2 Phosphorylierung der angelagerten Oligonukleotide 38
3.2.1.18.3 Linearisierung des pSUPER.basic-Vektors 38
3.2.1.18.4 Dephosphorylierung des pSUPER.basic-Vektors 38
3.2.1.18.5 Ligation der 64 bp Oligonukleotide mit dem
pSUPER.basic-Vektor 39
3.2.1.18.6 Selektion positiver Klone 39
3.2.1.19 Hemmung der ARFRP1-Expression mittels siRNA-Oligonukleotiden .39
3.2.2 Zellbiologische Methoden 40
3.2.2.1 Kultivierung der Zelllinien 40
3.2.2.2 Transiente Transfektion von Zellen 40
3.2.2.3 Adhäsions-/\ssay 40
3.2.3 Analytische Methoden 41
3.2.3.1 Herstellung von Zelllysaten 41
3.2.3.2 Isolation von Proteinen aus murinen Geweben 41
3.2.3.3 Proteingehaltsbestimmung 41
3.2.3.4 Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese 41
II
3.2.3.5 Transfer elektrophoretisch aufgetrennter Proteine auf Nitrozellulose-
membranen 43
3.2.3.6 Wesfem-ß/of-Analyse 43
3.2.3.7 Immunopräzipitation 43
3.2.3.8 Indirekte Immunzytochemie und konfokale Laser-Scanning-
Mikroskopie 44
3.2.3.9 Histologie und indirekte Immunhistochemie 44
3.2.3.9.1 Paraformaldehyd-Fixierung und Gewebeeinbettung 44
3.2.3.9.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) 45
3.2.3.9.3 Perjodsäure-Schiff (PAS)-Färbung 46
3.2.3.9.4 Indirekte Immunhistochemie 46
3.2.3.9.5 Mikroskopie 47
3.2.3.9.6 Immunhistochemische Analyse der subzellulären Verteilung von
E-Cadherin 47
3.2.4 Konditionale Inaktivierung des Arfrp1-Ger\s in der Maus 47
3.2.4.1 Klonierung des /\rf/p7flox-Zielvektors 48
3.2.4.2 Kultivierung embryonaler Stammzellen 49
3.2.4.3 Homologe Rekombination in ES-Zellen 49
3.2.4.4 PCR-Analyse von ES-Zellklonen auf homologe Rekombination 50
3.2.4.4.1 PCR-Nachweis der ersten loxP-s/te in ES-Zellklonen nach
homologer Rekombination 51
3.2.4.5 Nachweis der einmaligen Rekombination des Targef/ng-Konstrukts 51
3.2.4.6 Transiente Cre-Expression in homolog rekombinierten ES-
Zellklonen 51
3.2.4.7 Nachweis verschiedener Cre-vermittelter Rekombinationsereignisse. 52
3.2.4.8 Analyse der Chimären auf Keimbahngängigkeit 52
3.2.4.9 Zucht der Darm-spezifischen Arfrpi-Knockout-Maus und
Genotypisierung 53
3.2.4.9.1 Verpaarungsstrategie 53
3.2.4.9.2 Haltungsbedingungen 53
3.2.4.9.3 Genotypisierung der Versuchstiere 53
4 Ergebnisse 55
4.1 Die Rolle von ARFRP1 für die Golgi-Rekrutierung von Proteinen 55
4.1.1 ARFRP1-GTP ko-lokalisiert mit ARL1 am frans-Golgi-Kompartiment 55
4.1.2 Inaktives ARFRP1 inhibiert die Golgi-Assoziation von Golgin-245 56
4.1.3 Hemmung der ARFRP1-Expression mittels RNA-Interferenz 57
4.1.4 Knockdown von ARFRP1 in HeLa-Zellen führte zu einer Dissoziation
III
von ARL1 vom Golgi-Apparat 58
4.1.5 Hemmung der ARFRP1-Expression verhindert die ARL1 -abhängige
Rekrutierung von Golgin-245 an den Golgi-Apparat 59
4.1.6 Die Struktur des c/s-Golgi ist in Abwesenheit von ARFRP1 nicht verändert
62
4.2 Die Rolle von ARFRP1 für das Targeting von Adhäsionsproteinen 64
4.2.1 ARFRP1 ist für das Targeting von E-Cadherin an die Plasmamembran
essentiell 64
4.2.2 Das ARFRP1-regulierte Targeting von E-Cadherin ist unabhängig von
der Golgi-Assoziation von ARL1 68
4.2.3 Die Abwesenheit von E-Cadherin an der Zelloberfläche nach
Hemmung der ARFRP1-Expression ist nicht auf eine verstärkte
endozytotische Internalisierung zurückzuführen 69
4.2.4 ARFRP1 ist in einem Komplex mit E-Cadherin, ß-Catenin, a-Catenin
und p^O*" assoziiert 70
4.2.5 ARFRPI-Knoc/ccfown-Zellen zeigten eine reduzierte E-Cadherin-
vermittelte Zeil-Adhäsion 72
4.3 Konditionelle Mutagenese des Arfrp1-Gens 75
4.3.1 Herstellung des /\A/Äp7-7arge#ngr-Konstrukts 75
4.3.2 Homologe Rekombination des Zielvektors in das Genom embryonaler
Stammzellen 75
4.3.3 Nachweis der homologen Rekombination 76
4.3.4 Nachweis der ersten loxP-Erkennungsstelle 77
4.3.5 Analyse der einmaligen Integration des Konstrukts in das
ES-Zellgenom 79
4.3.6 Nachweis der Deletionsereignisse nach Expression der Cre-
Rekombinase 80
4.3.7 Gewinnung chimärer Mäuse und Nachweis der Keimbahn-
transmission 81
4.3.8 Zucht und Genotypisierung der Arfrp1vl]~'~-Maus 82
4.4 Phänotypische Charakterisierung der Darm-spezifischen Arfrpi-
Knoc/couf-Maus 82
4.4.1 Nachweis der Arfrpi-Deletion mittels RT-PCR und Westem-Blot-
Analyse 83
4.4.2 Die Darm-spezifische Deletion von Arfrpi resultierte in einer
Wachstumsretardierung der Mäuse 84
4.4.3 Histopathologische Defekte im Intestinaltrakt von Arfrpfvil/"-Mäusen 85
IV
4.4.4 /\r//p7vll/"-Mäuse wiesen eine abnormale Differenzierung von
Becher- und Paneth-Zellen auf 85
4.4.5 Verlust von ARFRP1 im Dünndarm führte zu einer erhöhten Zeil-
proliferation und Extension des Krypten-Kompartiments 89
4.4.6 Charakterisierung der subzellulären Lokalisation von E-Cadherin
\n der Arfrpfiy'-Maus 90
5 Diskussion 93
5.1 ARFRP1 reguliert die ARL1-abhängige Golgi-Rekrutierung des GRIP-
Domäne-Proteins Golgin-245 93
5.2 ARFRP1 ist für das Targeting von E-Cadherin an die Zelloberfläche und
die E-Cadherin-vermittelte Adhäsion essentiell 96
5.3 Die Funktion von ARFRP1 für die Differenzierung des Darmepithels 101
6 Literaturverzeichnis 109
7 ANHANG
7.1 Abkürzungsverzeichnis
7.2 Abbildungsverzeichnis
V
7.2 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Regulation des Aktivitätszustands monomerer GTPasen 5
Abb. 2: Übersicht über die Funktion und Lokalisation von Mitgliedern der Ras-
Superfamilie 9
Abb. 3: Vereinfachte Darstellung der Cadherin-abhängigen interzellulären Adhäsion.
14
Abb. 4: Schematische Darstellung des Wnt-Signaltransduktionswegs 15
Abb. 5: Gewebearchitektur und Zelltypzusammensetzung des adulten
Dünndarmepithels 18
Abb. 6: Mutagenese des Arfrpi-Z\e\vekiors zur konditioneilen Inaktivierung des
Arfrp1-Gens 48
Abb. 7: ARFRP1-GFP beeinflusst die subzelluläre Lokalisation von endogenem
ARL1 in HeLa-Zellen 55
Abb. 8: Subzelluläre Lokalisation von Golgin-245 (A, B) nach Expression von
konstitutiv aktivem oder inaktivem ARL1 (A) und konstitutiv aktivem oder
inaktivem ARFRP1 (B) in HeLa-Zellen 57
Abb. 9: Hemmung der ARFRP1-GFP-Expression (A) und der endogenen ARFRP1-
Expression (B) mittels RNA-Interferenz in COS-7- (A) und HeLa-Zellen (B).
58
Abb. 10: Subzelluläre Lokalisation von ARL1 nach Hemmung der ARFRP1-
Expression in HeLa-Zellen 59
Abb. 11: Knockdown der ARFRP1-Expression in HeLa-Zellen zerstörte die Golgi-
Assoziation von ARL1-Q71L (A), endogenem ARL1 (B) und des ARL1-
Effektors Golgin-245 (A, B) 61
Abb. 12: Die Hemmung der ARFRP1-Expression ändert nicht die Golgi-Verteilung
der Golgi-Matrix-Proteine GM130 und Giantin 63
Abb. 13: Depletion der ARFRP1-Expression in HeLa-Zellen ändert die Struktur des
TGN und die Verteilung von Syntaxin-6 64
Abb. 14: Inhibierung der ARFRP1-Expression in HeLa-Zellen beeinträchtigt das
Targeting von E-Cadherin an die Zelloberfläche 65
Abb. 15: Inhibierung der ARFRP1-Expression in HeLa-Zellen beeinträchtigt nicht die
Lokalisation von N-Cadherin oder ß-Catenin an der Plasmamembran 66
Abb. 16: Effekt der ARFRP1-Depletion auf die Expression von E-Cadherin, N-
Cadherin und a-Tubulin in HeLa-Zellen 67
Abb. 17: Das ARFRP1-regulierte Targeting von E-Cadherin ist unabhängig von der
Golgi-Lokalisation von ARL1 68
Abb. 18: Eine reduzierte Zelloberflächenlokalisation von E-Cadherin in ARFRP1-
depletierten Zellen ist keine Folge einer verstärkten endozytotischen
Intemalisierung von E-Cadherin 70
Abb. 19: ARFRP1 ko-immunopräzipitiert mit Bestandteilen des E-Cadherin-Catenin-
Komplexes 71
Abb. 20: Depletion von ARFRP1 führte zu verminderter Zeil-Adhäsion 73
Abb. 21: Schematische Darstellung der homologen Rekombination des Arfrpi"0"-
Targeting-Vektors in den/\/fApt-Locus 76
Abb. 22: PCR-basierte Analyse auf homologe Rekombination des Targeting-Vektors
in das ES-Zellgenom 77
Abb. 23: PCR-Nachweis der ersten loxP-s/te 78
Abb. 24: Nachweis des einmaligen Rekombinationsereignisses in den ES-Zellklonen
17, 59 und 243 79
Abb. 25: Schematische Darstellung des PCR-Nachweises der Rekombinations¬
ereignisse nach transienter Cre-Rekombinase-Transfektion 80
Abb. 26: PCR-basierter Nachweis der Cre-vermittelten Rekombinationsereignisse.81
Abb. 27: Genotypisierung dery4/f/p7vil/~-Mäuse 82
Abb. 28: Selektive Deletion des Arfrp7-Gens im Intestinaltrakt 84
Abb. 29: Postnatale Wachstumsretardierung von Arfrp 7vll/"-Mäusen 85
Abb. 30: Arfrpfvll"/"-"Mäuse zeigen eine massive Reduktion reifer Becherzellen 87
Abb. 31: Deletion von Arfrpi im Colon beeinträchtigt die Differenzierung von Becher-
Zellen, jedoch nicht die Bildung von enteroendokrinen Zellen 88
Abb. 32: Arfrp 1 ^'"'"-Mäuse wiesen eine gestörte Differenzierung von Paneth-Zellen
auf 89
Abb. 33: Kryptenhyperplasie und verstärkte Ki67-Färbung in Arfrp 1 vll/"-Mäusen 90
Abb. 34: Veränderte E-Cadherin-Verteilung in den Krypten der/lAf/p7v'l"/"-Mäuse.91
Abb. 35: Lokalisation von E-Cadherin im Villusepithel der Darm-spezifischen Arfrpi-
Nullmutante 92
Abb. 36:Modell für die Rolle von ARFRP1 am frans-Golgi-Netzwerk und für das E-
Cadherin-Targeting zur Plasmamembran 98 |
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