Wirkungen von nichtsteriodalen Antirheumatika und Methotrexat auf Extremitätenknospen von Mäuseembryonen in vitro:
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| adam_text | Titel: Wirkungen von nichtsteriodalen Antirheumatika und Methotrexat auf Extremitätenknospen von Mäuseemb
Autor: Philipp, Andrea
Jahr: 2008
III
INHALTSVERZEICHNIS Seite
1 EINLEITUNG 1
1.1 Nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR) und Methotrexat 1
1.1.1 Allgemeines 1
1.1.2 Wirkmechandsmus, Struktur- und Wirkungsbeziehungen, unerwünschte
Wirkungen und Pharmakokinetik 1
1.1.2.1 NSAR 9
1.1.2.2 Methotrexat-Dinatrium (MTX) 11
1.2 Teratogene Wirkungen nichtsteroidaler Antirheumatika und
Methotrexat im Tierexperiment und in der Schwangerschaft beim
Menschen 13
1.2.1 Allgemeines 13
1.2.2 NSAR und Methotrexat-Dinatrium (MTX) im Tierexperiment 15
1.2.2.1 NSAR 15
1.2.2.2 Methotrexat-Dinatrium (MTX) 17
1.2.3 NSAR und Methotrexat-Dinatrium (MTX) in der Schwangerschaft beim
Menschen 18
1.2.3.1 NSAR 18
1.2.3.2 Methotrexat-Dinatrium (MTX) 20
1.3 Morphogenese der „limb buds der Maus 21
1.3.1 Entwicklung der „limb buds in vitro 21
1.3.2 Ausrichtung der Körperachsen 23
1.3.3 Knorpelentwicklung 25
1.3.3.1 Mesenchymale Proliferation 26
1.3.3.2 Mesenchymale Zellkondensation und Adhäsion 27
1.3.3.3 Chondrozytendetermination und Apoptose 27
1.3.3.4 Chondrozytenreifung bzw. en- und perichondrale Ossifikation 28
1.4 Zusammensetzung der Knorpelmatrix 29
1.4.1 Kollagen 29
1.4.2 Proteoglykane 29
1.4.3 Fibronektin 30
IV
1.4.4 Matrix-Metallo-Proteasen (MMP) 31
1.4.5 Laminin 32
1.4.6 Chondrozyten und Zeil-Matrix Interaktion 32
1.4.6.1 Integrine und Zeil-Matrix Interaktion 32
1.4.6.1.1 Struktur und Nomenklatur der Integrine 32
1.4.6.1.2 Integrinexpression auf Chondrozyten 33
1.4.6.1.3 Funktionsweise der Integrine 34
1.5 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 34
2 MATERIAL UND METHODEN 36
2.1 Chemikalien 36
2.1.1 Acetylsalicylsäure und Natriumsalicylat 36
2.1.2 Diclofenac-Dinatrium 36
2.1.3 Celecoxib 36
2.1.4 Parecoxib-Dinatrium 36
2.1.5 Methotrexat-Dinatrium (MTX) 36
2.2 Standardmedium, Pufferlösung und Kulturmedium 37
2.2.1 Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 37
2.2.2 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 37
2.2.3 Biggerslösung 37
2.3 Tiere und Tierhaltung 39
2.3.1 Mäuse 39
2.4 „Limb bud Kulturen 39
2.4.1 Allgemeine Angaben zum Verfahren 39
2.4.2 Herstellung der Suspensionskultur (nach Blankenburg, 1981) 40
2.5 Färbung der Extremitätenanlagen 41
2.5.1 Alcianblau-Färbung (nach Romeis, 1989) 41
2.5.2 Fotographische Dokumentation 41
2.6 Morphologische Untersuchungen 42
2.6.1 Immunhistochemische Untersuchungen von Gefrierschnitten 42
2.6.1.1 Verfahren der indirekten hnmunfluoreszenztechnik 42
2.6.1.2 Antikörper 42
V
2.6.1.2.1 Primäre Antikörper 42
2.6.1.2.2 Sekundäre Antikörper... 43
2.6.1.3 Herstellung von Gefrierschnitten 43
2.6.1.3.1 Vorbereitung für die Immunmarkierung 44
2.6.1.3.2 Enzymatische Vorbehandlung 44
2.6.1.3.3 Immunmarkierung von Gefrierschnitten 45
2.6.1.3.4 Visualisierung 45
2.6.1.3.5 Fotographische Dokumentation 46
2.6.1.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungen 46
3 ERGEBNISSE 47
3.1 Entwicklung der „limb bud Kulturen 47
3.2 Einfluß von nichtsteroidalen Antirheumatika und Methotrexat
auf das Wachstum und die morphogenetische Differenzierung der
„limb buds in vitro 50
3.2.1 NSAR 51
3.2.1.1 Acetylsalicylsäure 51
3.2.1.2 Natriumsalicylat 54
3.2.1.3 Diclofenac-Dinatrium 54
3.2.1.4 Celecoxib 58
3.2.1.5 Parecoxib-Dinatrium 60
3.2.2 Methotrexat-Dinatrium (MTX) 61
3.2.3 Zusammenfassung von 3.2.1 und 3.2.2 69
3.3 Immunhistochemische Untersuchungen der „limb buds 70
3.3.1 Immunhistochemische Untersuchungen der „limb buds von 11 Tage
alten Mäuseembryonen nach einer Kulturdauer von 6 Tagen 70
3.3.2 Immunhistochemische Untersuchungen der Knorpelmatrix 71
3.3.2.1 Färbungen mit einem Antikörper gegen Kollagen Typ II 71
3.3.2.2 Färbungen mit einem Antikörper gegen Laminin-Bl 74
3.3.2.3 Färbungen mit einem Antikörper gegen Matrix-Metallo-Protease-1
(MMP-1) 76
3.3.2.4 Färbungen mit einem Antikörper gegen Fibronektin 78
VI
3.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungen der „limb buds 78
3.4.1 Elektronenmikxoskopische Untersuchung der „limb buds von 11 Tage
alten Mäuseembryonen nach einer Kulturdauer von 6 Tagen 78
3.4.2 Elektronenmikroskopische Darstellung der „limb buds von 12 Tage
alten Mäuseembryonen nach einer Kulturdauer von 6 Tagen 82
4 DISKUSSION 88
4.1 Unterschiedliche Untersuchungsmethoden zur Risikoabschätzung
embryotoxischer bzw. teratogener Wirkungen der NSAR oder
Methotrexat 88
4.2 Wirkungen von NSAR oder Methotrexat auf die Entwicklung der
„limb buds von Mäuseembryonen in vitro 89
4.3 Tierexperimentelle und Klinische Daten 96
5 ZUSAMMENFASSUNG 99
6 LITERATURVERZEICHNIS 102
7 VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN 123
|
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Titel: Wirkungen von nichtsteriodalen Antirheumatika und Methotrexat auf Extremitätenknospen von Mäuseemb
Autor: Philipp, Andrea
Jahr: 2008
III
INHALTSVERZEICHNIS Seite
1 EINLEITUNG 1
1.1 Nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR) und Methotrexat 1
1.1.1 Allgemeines 1
1.1.2 Wirkmechandsmus, Struktur- und Wirkungsbeziehungen, unerwünschte
Wirkungen und Pharmakokinetik 1
1.1.2.1 NSAR 9
1.1.2.2 Methotrexat-Dinatrium (MTX) 11
1.2 Teratogene Wirkungen nichtsteroidaler Antirheumatika und
Methotrexat im Tierexperiment und in der Schwangerschaft beim
Menschen 13
1.2.1 Allgemeines 13
1.2.2 NSAR und Methotrexat-Dinatrium (MTX) im Tierexperiment 15
1.2.2.1 NSAR 15
1.2.2.2 Methotrexat-Dinatrium (MTX) 17
1.2.3 NSAR und Methotrexat-Dinatrium (MTX) in der Schwangerschaft beim
Menschen 18
1.2.3.1 NSAR 18
1.2.3.2 Methotrexat-Dinatrium (MTX) 20
1.3 Morphogenese der „limb buds" der Maus 21
1.3.1 Entwicklung der „limb buds" in vitro 21
1.3.2 Ausrichtung der Körperachsen 23
1.3.3 Knorpelentwicklung 25
1.3.3.1 Mesenchymale Proliferation 26
1.3.3.2 Mesenchymale Zellkondensation und Adhäsion 27
1.3.3.3 Chondrozytendetermination und Apoptose 27
1.3.3.4 Chondrozytenreifung bzw. en- und perichondrale Ossifikation 28
1.4 Zusammensetzung der Knorpelmatrix 29
1.4.1 Kollagen 29
1.4.2 Proteoglykane 29
1.4.3 Fibronektin 30
IV
1.4.4 Matrix-Metallo-Proteasen (MMP) 31
1.4.5 Laminin 32
1.4.6 Chondrozyten und Zeil-Matrix Interaktion 32
1.4.6.1 Integrine und Zeil-Matrix Interaktion 32
1.4.6.1.1 Struktur und Nomenklatur der Integrine 32
1.4.6.1.2 Integrinexpression auf Chondrozyten 33
1.4.6.1.3 Funktionsweise der Integrine 34
1.5 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 34
2 MATERIAL UND METHODEN 36
2.1 Chemikalien 36
2.1.1 Acetylsalicylsäure und Natriumsalicylat 36
2.1.2 Diclofenac-Dinatrium 36
2.1.3 Celecoxib 36
2.1.4 Parecoxib-Dinatrium 36
2.1.5 Methotrexat-Dinatrium (MTX) 36
2.2 Standardmedium, Pufferlösung und Kulturmedium 37
2.2.1 Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 37
2.2.2 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 37
2.2.3 Biggerslösung 37
2.3 Tiere und Tierhaltung 39
2.3.1 Mäuse 39
2.4 „Limb bud" Kulturen 39
2.4.1 Allgemeine Angaben zum Verfahren 39
2.4.2 Herstellung der Suspensionskultur (nach Blankenburg, 1981) 40
2.5 Färbung der Extremitätenanlagen 41
2.5.1 Alcianblau-Färbung (nach Romeis, 1989) 41
2.5.2 Fotographische Dokumentation 41
2.6 Morphologische Untersuchungen 42
2.6.1 Immunhistochemische Untersuchungen von Gefrierschnitten 42
2.6.1.1 Verfahren der indirekten hnmunfluoreszenztechnik 42
2.6.1.2 Antikörper 42
V
2.6.1.2.1 Primäre Antikörper 42
2.6.1.2.2 Sekundäre Antikörper. 43
2.6.1.3 Herstellung von Gefrierschnitten 43
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2.6.1.3.3 Immunmarkierung von Gefrierschnitten 45
2.6.1.3.4 Visualisierung 45
2.6.1.3.5 Fotographische Dokumentation 46
2.6.1.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungen 46
3 ERGEBNISSE 47
3.1 Entwicklung der „limb bud" Kulturen 47
3.2 Einfluß von nichtsteroidalen Antirheumatika und Methotrexat
auf das Wachstum und die morphogenetische Differenzierung der
„limb buds" in vitro 50
3.2.1 NSAR 51
3.2.1.1 Acetylsalicylsäure 51
3.2.1.2 Natriumsalicylat 54
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3.2.3 Zusammenfassung von 3.2.1 und 3.2.2 69
3.3 Immunhistochemische Untersuchungen der „limb buds" 70
3.3.1 Immunhistochemische Untersuchungen der „limb buds" von 11 Tage
alten Mäuseembryonen nach einer Kulturdauer von 6 Tagen 70
3.3.2 Immunhistochemische Untersuchungen der Knorpelmatrix 71
3.3.2.1 Färbungen mit einem Antikörper gegen Kollagen Typ II 71
3.3.2.2 Färbungen mit einem Antikörper gegen Laminin-Bl 74
3.3.2.3 Färbungen mit einem Antikörper gegen Matrix-Metallo-Protease-1
(MMP-1) 76
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VI
3.4 Elektronenmikroskopische Untersuchungen der „limb buds" 78
3.4.1 Elektronenmikxoskopische Untersuchung der „limb buds" von 11 Tage
alten Mäuseembryonen nach einer Kulturdauer von 6 Tagen 78
3.4.2 Elektronenmikroskopische Darstellung der „limb buds" von 12 Tage
alten Mäuseembryonen nach einer Kulturdauer von 6 Tagen 82
4 DISKUSSION 88
4.1 Unterschiedliche Untersuchungsmethoden zur Risikoabschätzung
embryotoxischer bzw. teratogener Wirkungen der NSAR oder
Methotrexat 88
4.2 Wirkungen von NSAR oder Methotrexat auf die Entwicklung der
„limb buds" von Mäuseembryonen in vitro 89
4.3 Tierexperimentelle und Klinische Daten 96
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