3ß-Hydroxysteroiddehydrogenasen aus Digitalis lanata und Erysimum crepidifolium:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2008
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
A Einleitung 1
A 1. Die Verbreitung herzwirksamer Glykoside in der Pflanzenwelt 1
A 2. Die Gattungen Digitalis L. und Erysimum L 2
A2.1 Inhaltsstoffgruppen in Digitalis und Erysimum 3
A2.2 Herzwirksame Glykoside in Digitalis und Erysimum 3
A 2.3 Herzwirksame Glykoside in D. lanata und E. crepidifolium 6
A 2.4 Anwendung herzwirksamer Glykoside 7
A 3. Putativer Biosyntheseweg des Cardenolidgrundgerüsts in Digitalis 8
A4. Die 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (3ß-HSD) 10
A5. Problemstellung 12
B Material und Methoden 13
B 1 Allgemein 13
B1.1 Wasser 13
B 1.2 Proteinbestimmung 13
B 1.3 Entsalzen, Umpuffern und Einengen von Proteinlösungen 14
B 1.4 Dünnschichtchromatographie (DC) 14
B 1.5 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie(HPLC) 15
B1.6SDS-Page 15
B 1.6.1 Gelzusammensetzung und Probenvorbereitung 16
B 1.6.2 Lösungen und Puffer 16
B 1.7 Isoelektrische Fokussierung 17
B 1.8 Silberfärbung 18
B 2 Rekombinante Form der 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (pQ3ß-HSD) 19
B2.1 Expression der pQ3ß-HSD 19
B2.2 Native His-tag-Reinigung der pQ3ß-HSD 20
B 2.2.1 Proteinextraktion 20
B 2.2.2 Reinigung unter nativen Bedingungen 20
B 2.2.3 Verwendete Puffer 21
B 2.3 Standardassay der pQ3ß-HSD 21
B 2.4 Untersuchungen zur Ketosteroidisomeraseaktivität 23
B 3 Native 3ß-HSD aus Erysimum-Men 23
B 3.1 Pflanzen- und Kulturmaterial 23
B 3.2 Kulturbedingungen und Nährmedien 24
B 3.2.1 Sprosskulturen 24
Inhaltsverzeichnis .
B 3.2.2 Kalluskulturen 25
B 3.2.3 Suspensionskulturen 25
B 3.2.4 Zusammensetzung der verwendeten Nährmedien 25
B3.3 Herzglykosidspektrum in Erysimum crepidifolium 27
B 3.4 Enzymextraktion 27
B 3.5 Standardassay der nativen 3ß-HSD 28
B 3.6 Proteinreinigung 29
B 3.6.1 Ammoniumsulfatfällung 30
B 3.6.2 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylsepharose 6FF 30
B 3.6.3 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 31
B 3.6.4 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow... 32
B 3.6.5 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 33
B 3.6.6 Gelfiltration an Superdex 75 33
B 4 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 34
B4.1 Chemikalien 34
B 4.2 Verbrauchsmaterialien 36
B 5 Geräte und Zubehör 37
C Ergebnisse 40
C 1 Rekombinante Form der 3ß-HSD aus Digitalis lanata (pQ3ß-HSD) 40
C 1.1 Nachweis der katalytischen Aktivität 40
C 1.2Substratspezifrtät 41
C 1.2.1 Substrate für die Oxidationsreaktion 43
C 1.2.1.1 Steroide mit ß-ständiger C3-Hydroxylgruppe 43
C 1.2.1.2 Steroide mit a-ständiger C3-Hydroxylgruppe 47
C 1.2.1.3 Steroide mit ß-ständiger C17-Hydroxylgruppe 48
C 1.2.2 Substrate für die Reduktionsreaktion 49
C 1.3Cosubstratspezifität 51
C 1.4 Stabilitätstest 52
C 1.4.1 Stabilitätstest bei 4 C 52
C 1.4.2 Stabilitätstest bei -20 C und -80 C 53
C 1.5 pH-Optimum 54
C 1.5.1 pH-Optimum der Oxidationsreaktion 54
C 1.5.2 pH-Optimum der Reduktionsreaktion 55
C 1.6 Temperaturoptimum 55
Inhaltsverzeichnis
C 1.6.1 Temperaturoptimum der Oxidationsreaktion 56
C 1.6.2 Temperaturoptimum der Reduktionsreaktion 56
C 1.7 Einfluss zweiwertiger Metallionen 57
C 1.8 Bestimmung des isoelektrischen Punktes 58
C 1.9 Enzymkinetik 58
C 1.9.1 Enzymkinetik ausgewählter Substrate der Oxidationsreaktion 59
C 1.9.2 Enzymkinetik ausgewählter Substrate der Reduktionsreaktion 62
C 1.9.3 Enzymkinetik der Cosubstrate 64
C 1.9.3.1 NAD als Cosubstrat 64
C 1.9.3.2 NADH als Cosubstrat 65
C 1.9.4 Enzymkinetische Daten im Überblick 66
C 1.10 Untersuchungen der pQ3ß-HSD auf Ketosteroidisomeraseaktivität....66
C 1.10.1 Aktivitätsvergleich von Suspensionskultur und pQ3ß-HSD (O. lanata)
66
C 1.10.2 KSI aus D. lanata in Abhängigkeit der Proteinkonzentration 68
C 1.10.3 Untersuchung auf KSI-Aktivität bei KSI-Bedingungen 69
C 1.10.4 Untersuchung auf KSI-Aktivität bei 3ß-HSD-Bedingungen 70
C 1.10.5 Untersuchung auf KSI-Aktivität mit verschiedenen Substraten 71
C 1.10.6 Zeitkinetik der Autoisomerisierung mit verschiedenen Cosubstraten
72
C 1.11 Kontrollexperimente mit Bakterienkultur 73
C 2 Native 3ß-HSD aus Erysimum crepidifolium (Ecre3ß-HSD) 76
C 2.1 Nachweis der katalytischen Aktivität 76
C 2.1.1 Aktivität in E. allionii 76
C 2.1.2 Aktivität in E. crepidifolium 77
C 2.2 Herzwirksame Glykoside in E. crepidifolium 78
C 2.3 Vorversuche mit E. crepidifolium - Suspensionskultur 79
C 2.3.1 Korrelation zwischen Enzymaktivität und Proteingehalt bei langer
Inkubationszeit 79
C 2.3.2 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Inkubationszeit 80
C 2.3.3 Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 81
C 2.3.4 Untersuchung der Salzabhängigkeit 82
C 2.3.5 Bestimmung der Aktivität mit NaR pH 6,0 - 7,8 83
C 2.3.6 Extraktionspuffervergleich von NaPi pH 6,4 mit pH 7,8 84
Inhaltsverzeichnis
C 2.3.7 Thermische Behandlung des Rohextraktes 85
C 2.3.8 Korrelation zwischen Proteingehalt und Enzymaktivität bei pH 6,4 ... 86
C 2.3.9 Ermittlung der Inkubationszeit 87
C 2.3.10 Substratspezifität bei pH 6,4 und 7,8 88
C 2.3.11 Bestimmung des pH-Optimums 90
C 2.3.12 Stabilitätstest mit verschiedenen Pufferzusätzen 91
C 2.3.12.1 Stabilität mit Pregnenolon als Substrat 92
C 2.3.12.2 Stabilität mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 93
C 2.3.13 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylsepharose 6FF
94
C 2.3.14 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow.. 97
C 2.3.15 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 98
C 2.3.16 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 100
C 2.4 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Suspensionskultur
102
C 2.4.1 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 102
C 2.4.2 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 103
C 2.4.3 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose FF 103
C 2.4.4 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 105
C 2.4.5 Gelfiltration an Superdex 75 106
C 2.4.6 SDS-Page 107
C 2.4.7 Reinigungsbilanz 108
C 2.5 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Blattmaterial 109
C 2.5.1 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 109
C 2.5.2 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 110
C 2.5.3 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose FF 110
C 2.5.4 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 112
C 2.5.5 Gelfiltration an Superdex 75 114
C 2.5.6 SDS-Page 115
C 2.5.7 Reinigungsbilanz 117
C 2.6 Stabilität bei -20*C 118
C 2.7 Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 118
D Diskussion 121
D 1 Rekombinante Form der 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase aus D. lanata.. 121
Inhaltsverzeichnis
D 1.1 Substratspezifität 121
D 1.1.1 Steroide mit ß-ständiger C3-Hydroxylgruppe 122
D 1.1.2 Steroide mit a-ständiger C3-Hydroxylgruppe 123
D 1.1.3 17ß-Oxidoreduktaseaktivität 124
D 1.1.4. Reduktionsreaktionen der pQ3ß-HSD 124
D1.2Cosubstratspezifität 127
D 1.3 Inhibierung durch zweiwertige Metallionen 128
D 1.4 pH-Optimum und isoelektrischer Punkt 128
D 1.5 Temperaturoptimum 129
D 1.6 Enzymkinetik 130
D 1.7 Untersuchungen der pQ3ß-HSD bezüglich Ketosteroidisomeraseaktivität
132
D2 Native 3ß-HSD aus Erysimum crepidifolium 138
D 2.1 Vorversuche zur Reinigung der Ecre3ß-HSD 138
D 2.1.1 Vorversuche mit Pregnenolon und 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 140
D 2.2 pH-Optimum 142
D 2.3 Stabilität 143
D 2.4 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Suspensionskultur
143
D 2.5 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus £. crepidifolium - Blattmaterial 145
D 2.6 Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 148
E Zusammenfassung 151
ESummary 152
F Literaturverzeichnis 153
G Anhang 161
G 1. Abkürzungsverzeichnis 161
G2. Abbildungsverzeichnis 162
G 3. Tabellenverzeichnis 166
G4. Publikationsliste 167
Anhang
G 2. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Gemeinsame Zuckerkomponenten der herzwirksamen Glykoside aus
Erysimum und Digitalis 5
Abbildung 2 Postulierter Biosyntheseweg des Cardenolidgrundgerüstes in Digitalis.»
Abbildung 3 Reaktionsmechanismus der tierischen 3ß-HSD am Beispiel von
Pregnenolon als Substrat 11
Abbildung 4 DC des Aktivitätstests pQ3ß-HSD mit unterschiedlichen
Proteinkonzentrationen und Inkubationszeiten 40
Abbildung 5 Getestete Substrate der pQ3ß-HSD 42
Abbildung 6 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3ß-ol-20-on als
Substrat 43
Abbildung 7 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als
Substrat 44
Abbildung 8 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 21-OH-Pregnenolon als Substrat.
44
Abbildung 9 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5-Androsten-3ß-ol-17-on als
Substrat 45
Abbildung 10 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Xysmalogenin als Substrat 45
Abbildung 11 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Digitoxigenin als Substrat 46
Abbildung 12 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Cholesterol als Substrat 46
Abbildung 13 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3a-ol-20-on als
Substrat 47
Abbildung 14 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3a-ol-20-on als
Substrat 48
Abbildung 15 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Testosteron als Substrat 48
Abbildung 16 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3,20-dion als
Substrat 49
Abbildung 17 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3,20-dion als
Substrat 50
Abbildung 18 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Progesteron als Substrat 50
Abbildung 19 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit4-Androsten-3,17-dion als
Substrat 51
Abbildung 20 Diagramm des Stabilitätstests bei 4 C. Die spezifische Aktivität pQ3ß-
HSD an verschiedenen Tagen 53
Abbildung 21 Diagramm der pH-Optimum-Bestimmung der pQ3ß-HSD für die
Oxidationsreaktion 54
Abbildung 22 Diagramm der pH-Optimum-Bestimmung der pQ3ß-HSD für die
Reduktionsreaktion 55
Abbildung 23 Diagramm der Bestimmung des Temperaturoptimums der
Oxidationsreaktion von pQ3ß-HSD 56
Abbildung 24 Diagramm der Bestimmung des Temperaturoptimums der
Reduktionsreaktion von pQ3ß-HSD 57
Abbildung 25 Diagramm des Einflusses zweiwertiger Metallionen auf die Aktivität
derpQ3ß-HSD 57
Abbildung 26 lEF-Gel der pQ3ß-HSD nach Silberfärbung 58
Abbildung 27 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Pregnenolon als
Substrat und Hanes-Plot 60
Abbildung 28 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-
20-on als Substrat und Hanes-Plot 60
162
Anhang
Abbildung 29 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3ß-ol-
20-on als Substrat und Hanes-Plot 61
Abbildung 30 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Androstenolon als
Substrat und Hanes-Plot 61
Abbildung 31 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Testosteron als
Substrat und Hanes-Plot 62
Abbildung 32 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3,20-
dion als Substrat und Hanes-Plot 63
Abbildung 33 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3,20-
dion als Substrat und Hanes-Plot 63
Abbildung 34 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als
Substrat und Hanes-Plot 64
Abbildung 35 Hanes-Auftragung von NAD 65
Abbildung 36 Hanes-Auftragung von NADH 65
Abbildung 37 Diagramm des Vergleiches von pQ3ß-HSD mit Rohextrakt (RE) von
Digitalis lanata 67
Abbildung 38 Diagramm der Ketosteroidisomeraseaktivität und Autoisomerisierung
in D. lanata bei verschiedenen Proteinkonzentrationen 69
Abbildung 39 Diagramm der Zeitkinetik mit Isoprogesteron als Substrat bei 37 C
(KSI-Bedingungen) 70
Abbildung 40 Diagramm der Zeitkinetik pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als Substrat
bei 50 C (3ß-HSD-Bedingungen) 70
Abbildung 41 Diagramm der Untersuchung von pQ3ß-HSD auf KSI-Aktivität mit
verschiedenen Substraten 72
Abbildung 42 Diagramm der Zeitkinetik pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als Substrat
und verschiedenen Cosubstraten 73
Abbildung 43 DC der Reaktion der Negativkontrolle (endogene Bakterienenzyme)
mit 5ß-Pregnan-3,20-dion und 5ß-Pregnan-3a-ol-20-on als Substrate 74
Abbildung 44 Diagramm der Reaktion der Negativkontrollen (endogene
Bakterienenzyme) der Substrate Isoprogesteron und Testosteron verglichen mit
der Reaktion von pQ3ß-HSD 75
Abbildung 45 DC des Aktivitätstests von Eall3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat.
77
Abbildung 46 DC des Aktivitätstests von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat.
77
Abbildung 47 DC der in E. crepidifolium enthaltenen herzwirksamen Glykoside 78
Abbildung 48 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei
verschiedenen Proteinkonzentrationen und Inkubation über Nacht 79
Abbildung 49 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei
verschiedenen Inkubationszeiten und gleich bleibender Proteinkonzentration. .80
Abbildung 50 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei
25 - 70%iger Ammoniumsulfatfällung 81
Abbildung 51 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat zur
Untersuchung der Salzabhängigkeit. 82
Abbildung 52 Bestimmung der Aktivität mit NaPi pH 6,0 - 7,8 bei 2,5 h lnkubation.83
Abbildung 53 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat im
Extraktionspuffervergleich bei 2 h Inkubation 84
Abbildung 54 Thermische Behandlung des Rohextraktes von E. crepidifolium 85
Abbildung 55 Diagramm zur Bestimmung des Einflusses des Proteingehalts auf die
Aktivität für Ecre3ß-HSD 86
163
Anhang
Abbildung 56 Diagramm zur Ermittlung des linearen Bereiches der Enzymaktivität in
Abhängigkeit von der Inkubationszeit für Ecre3ß-HSD 87
Abbildung 57 DC der Reaktionen von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon und
Testosteron als Substrate 88
Abbildung 58 DC der Reaktionen von Ecre3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on und
5ß-Pregnan-3,20-dion als Substrate 89
Abbildung 59 Diagramm zur Ermittlung des pH-Optimums der Ecre3ß-HSD mit
Pregnenolon als Substrat 90
Abbildung 60 Diagramm zur Ermittlung des pH-Optimums der Ecre3ß-HSD mit 5ß-
Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 91
Abbildung 61 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die Substrate
Pregnenolon und 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on an Tag 0 der Stabilitätsprüfung mit
verschiedenen Pufferzusätzen 92
Abbildung 62 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die
Stabilitätsprüfung mit Pregnenolon als Substrat 93
Abbildung 63 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die
Stabilitätsprüfung mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 93
Abbildung 64 Elutionsprofil an Phenylsepharose 6FF mit 0,8M (NH4 2SO4 95
Abbildung 65 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß-
HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 95
Abbildung 66 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an Phenylsepharose 6FF mit 0.75M
(NH4)2SO4 96
Abbildung 67 Diagramm der Aktivität der Ecre3ß-HSD1 vor und nach
Säulenchromatographie an Phenylsepharose 6FF 96
Abbildung 68 Elutionsprofil an SP Sepharose Fast Flow mit 0,5 M NaCI 97
Abbildung 69 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß-
HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 98
Abbildung 70 Elutionsprofil an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI 99
Abbildung 71 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß-
HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 99
Abbildung 72 Elutionsprofil an Source 30Q mit 0,5 M NaCI 100
Abbildung 73 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß-
HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 101
Abbildung 74 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung der Ecre3ß-HSD1 aus dem
Proteinrohextrakt bei Reinigung 1 102
Abbildung 75 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an SP Sepharose Fast Flow mit 0,5 M
NaCI bei Reinigung 1 104
Abbildung 76 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach
Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow bei Reinigung
1 104
Abbildung 77 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI bei
Reinigung 1 105
Abbildung 78 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach
Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP bei Reinigung 1 106
Abbildung 79 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Affinitätschromatographie an
HiTrap Blue HP bei Reinigung 1 107
Abbildung 80 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung der Ecre3ß-HSD1 aus dem
Proteinrohextrakt bei Reinigung 2 109
Abbildung 81 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an SP Sepharose Fast Flow mit 0.5 M
NaCI Reinigung 2 111
164
Anhang
Abbildung 82 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach
Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow Reinigung 2,
111
Abbildung 83 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI
Reinigung 2 112
Abbildung 84 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach
Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP Reinigung 2 113
Abbildung 85 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an Superdex 75 114
Abbildung 86 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Gelfiltration
an Superdex 75 115
Abbildung 87 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Affinitätschromatographie an
HiTrap Blue HP bei Reinigung 2 116
Abbildung 88 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Gelfiltration an Superdex 75.
116
Abbildung 89 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach
Stabilitätsprüfung bei-20 C 118
Abbildung 90 DC der Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 mit
Pregnenolon und Isoprogesteron als Substrate 119
Abbildung 91 DC der Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 mit 5ß-
Pregnan-3,20-dion und Testosteron als Substrate 120
Abbildung 92 Strukturmerkmale untersuchter Substrate 121
Abbildung 93 Zusammenspiel von 3a-HSD und 5a-Reduktase in der Ratte (nach
Wiebe et al., 1994) 125
Abbildung 94 Allgemeiner Mechanismus der nicht-enzymatischen Isomerisierung
nach Houck und Pollack (2003) 135
Abbildung 95 Reaktionsmechanismus der Ketosteroidisomerase nach Pollack
(2004) 136
165
Anhang
G 3. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Ausgewählte cardenolidführende Pflanzenfamilien und ihre Vertreter nach
Hansel und Sticher (2004) 1
Tabelle 2: Inhaltsstoffgruppen der Gattungen Digitalis und Erysimum neben den
Cardenoliden 3
Tabelle 3: Cardenolidgrundgerüst und die in den Gattungen Digitalis und Erysimum
vorkommenden Aglyka, abgewandelt nach Luckner und Wichtl (2000) 4
Tabelle 4: Hauptcardenolide in E. crepidifolium 7
Tabelle 5: Aktivität mit verschiedenen Cosubstraten 52
Tabelle 6: Km- und VmarWerte pQ3ß-HSD 66
Tabelle 7: Bilanz der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus Suspensionskultur von E.
crepidifolium 108
Tabelle 8: Bilanz der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus Blattmaterial von E.
crepidifolium 117
Tabelle 9: Enzyme für die Umwandlung von 5a- und 5ß-Pregnanen in Digitalis.... 125
Tabelle 10: Temperaturoptima der Hydroxysteroid-Oxidoreduktasen aus D/g/ta/Js.130
Tabelle 11: Substrate der pQ3ß-HSD und ihre kinetischen Konstanten im Vergleich
mit den von Finsterbusch et al. (1999) bestimmten Parameter 131
Tabelle 12: Vergleich der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium
Suspensionskultur und Blattmaterial 146
Tabelle 13: Gegenüberstellung einiger Eigenschaften der Ecre3ß-HSD1 und Dlan3ß-
HSD (Finsterbusch, 1999) 150
166
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Inhaltsverzeichnis
A Einleitung 1
A 1. Die Verbreitung herzwirksamer Glykoside in der Pflanzenwelt 1
A 2. Die Gattungen Digitalis L. und Erysimum L 2
A2.1 Inhaltsstoffgruppen in Digitalis und Erysimum 3
A2.2 Herzwirksame Glykoside in Digitalis und Erysimum 3
A 2.3 Herzwirksame Glykoside in D. lanata und E. crepidifolium 6
A 2.4 Anwendung herzwirksamer Glykoside 7
A 3. Putativer Biosyntheseweg des Cardenolidgrundgerüsts in Digitalis 8
A4. Die 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (3ß-HSD) 10
A5. Problemstellung 12
B Material und Methoden 13
B 1 Allgemein 13
B1.1 Wasser 13
B 1.2 Proteinbestimmung 13
B 1.3 Entsalzen, Umpuffern und Einengen von Proteinlösungen 14
B 1.4 Dünnschichtchromatographie (DC) 14
B 1.5 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie(HPLC) 15
B1.6SDS-Page 15
B 1.6.1 Gelzusammensetzung und Probenvorbereitung 16
B 1.6.2 Lösungen und Puffer 16
B 1.7 Isoelektrische Fokussierung 17
B 1.8 Silberfärbung 18
B 2 Rekombinante Form der 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (pQ3ß-HSD) 19
B2.1 Expression der pQ3ß-HSD 19
B2.2 Native His-tag-Reinigung der pQ3ß-HSD 20
B 2.2.1 Proteinextraktion 20
B 2.2.2 Reinigung unter nativen Bedingungen 20
B 2.2.3 Verwendete Puffer 21
B 2.3 Standardassay der pQ3ß-HSD 21
B 2.4 Untersuchungen zur Ketosteroidisomeraseaktivität 23
B 3 Native 3ß-HSD aus Erysimum-Men 23
B 3.1 Pflanzen- und Kulturmaterial 23
B 3.2 Kulturbedingungen und Nährmedien 24
B 3.2.1 Sprosskulturen 24
Inhaltsverzeichnis .
B 3.2.2 Kalluskulturen 25
B 3.2.3 Suspensionskulturen 25
B 3.2.4 Zusammensetzung der verwendeten Nährmedien 25
B3.3 Herzglykosidspektrum in Erysimum crepidifolium 27
B 3.4 Enzymextraktion 27
B 3.5 Standardassay der nativen 3ß-HSD 28
B 3.6 Proteinreinigung 29
B 3.6.1 Ammoniumsulfatfällung 30
B 3.6.2 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylsepharose 6FF 30
B 3.6.3 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 31
B 3.6.4 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow. 32
B 3.6.5 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 33
B 3.6.6 Gelfiltration an Superdex 75 33
B 4 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 34
B4.1 Chemikalien 34
B 4.2 Verbrauchsmaterialien 36
B 5 Geräte und Zubehör 37
C Ergebnisse 40
C 1 Rekombinante Form der 3ß-HSD aus Digitalis lanata (pQ3ß-HSD) 40
C 1.1 Nachweis der katalytischen Aktivität 40
C 1.2Substratspezifrtät 41
C 1.2.1 Substrate für die Oxidationsreaktion 43
C 1.2.1.1 Steroide mit ß-ständiger C3-Hydroxylgruppe 43
C 1.2.1.2 Steroide mit a-ständiger C3-Hydroxylgruppe 47
C 1.2.1.3 Steroide mit ß-ständiger C17-Hydroxylgruppe 48
C 1.2.2 Substrate für die Reduktionsreaktion 49
C 1.3Cosubstratspezifität 51
C 1.4 Stabilitätstest 52
C 1.4.1 Stabilitätstest bei 4 "C 52
C 1.4.2 Stabilitätstest bei -20 'C und -80 "C 53
C 1.5 pH-Optimum 54
C 1.5.1 pH-Optimum der Oxidationsreaktion 54
C 1.5.2 pH-Optimum der Reduktionsreaktion 55
C 1.6 Temperaturoptimum 55
Inhaltsverzeichnis
C 1.6.1 Temperaturoptimum der Oxidationsreaktion 56
C 1.6.2 Temperaturoptimum der Reduktionsreaktion 56
C 1.7 Einfluss zweiwertiger Metallionen 57
C 1.8 Bestimmung des isoelektrischen Punktes 58
C 1.9 Enzymkinetik 58
C 1.9.1 Enzymkinetik ausgewählter Substrate der Oxidationsreaktion 59
C 1.9.2 Enzymkinetik ausgewählter Substrate der Reduktionsreaktion 62
C 1.9.3 Enzymkinetik der Cosubstrate 64
C 1.9.3.1 NAD als Cosubstrat 64
C 1.9.3.2 NADH als Cosubstrat 65
C 1.9.4 Enzymkinetische Daten im Überblick 66
C 1.10 Untersuchungen der pQ3ß-HSD auf Ketosteroidisomeraseaktivität.66
C 1.10.1 Aktivitätsvergleich von Suspensionskultur und pQ3ß-HSD (O. lanata)
66
C 1.10.2 KSI aus D. lanata in Abhängigkeit der Proteinkonzentration 68
C 1.10.3 Untersuchung auf KSI-Aktivität bei KSI-Bedingungen 69
C 1.10.4 Untersuchung auf KSI-Aktivität bei 3ß-HSD-Bedingungen 70
C 1.10.5 Untersuchung auf KSI-Aktivität mit verschiedenen Substraten 71
C 1.10.6 Zeitkinetik der Autoisomerisierung mit verschiedenen Cosubstraten
72
C 1.11 Kontrollexperimente mit Bakterienkultur 73
C 2 Native 3ß-HSD aus Erysimum crepidifolium (Ecre3ß-HSD) 76
C 2.1 Nachweis der katalytischen Aktivität 76
C 2.1.1 Aktivität in E. allionii 76
C 2.1.2 Aktivität in E. crepidifolium 77
C 2.2 Herzwirksame Glykoside in E. crepidifolium 78
C 2.3 Vorversuche mit E. crepidifolium - Suspensionskultur 79
C 2.3.1 Korrelation zwischen Enzymaktivität und Proteingehalt bei langer
Inkubationszeit 79
C 2.3.2 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Inkubationszeit 80
C 2.3.3 Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 81
C 2.3.4 Untersuchung der Salzabhängigkeit 82
C 2.3.5 Bestimmung der Aktivität mit NaR pH 6,0 - 7,8 83
C 2.3.6 Extraktionspuffervergleich von NaPi pH 6,4 mit pH 7,8 84
Inhaltsverzeichnis
C 2.3.7 Thermische Behandlung des Rohextraktes 85
C 2.3.8 Korrelation zwischen Proteingehalt und Enzymaktivität bei pH 6,4 . 86
C 2.3.9 Ermittlung der Inkubationszeit 87
C 2.3.10 Substratspezifität bei pH 6,4 und 7,8 88
C 2.3.11 Bestimmung des pH-Optimums 90
C 2.3.12 Stabilitätstest mit verschiedenen Pufferzusätzen 91
C 2.3.12.1 Stabilität mit Pregnenolon als Substrat 92
C 2.3.12.2 Stabilität mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 93
C 2.3.13 Hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenylsepharose 6FF
94
C 2.3.14 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow. 97
C 2.3.15 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 98
C 2.3.16 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 100
C 2.4 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Suspensionskultur
102
C 2.4.1 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 102
C 2.4.2 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 103
C 2.4.3 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose FF 103
C 2.4.4 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 105
C 2.4.5 Gelfiltration an Superdex 75 106
C 2.4.6 SDS-Page 107
C 2.4.7 Reinigungsbilanz 108
C 2.5 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Blattmaterial 109
C 2.5.1 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung 25 - 70 % 109
C 2.5.2 Anionenaustauschchromatographie an Source 30Q 110
C 2.5.3 Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose FF 110
C 2.5.4 Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP 112
C 2.5.5 Gelfiltration an Superdex 75 114
C 2.5.6 SDS-Page 115
C 2.5.7 Reinigungsbilanz 117
C 2.6 Stabilität bei -20*C 118
C 2.7 Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 118
D Diskussion 121
D 1 Rekombinante Form der 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase aus D. lanata. 121
Inhaltsverzeichnis
D 1.1 Substratspezifität 121
D 1.1.1 Steroide mit ß-ständiger C3-Hydroxylgruppe 122
D 1.1.2 Steroide mit a-ständiger C3-Hydroxylgruppe 123
D 1.1.3 17ß-Oxidoreduktaseaktivität 124
D 1.1.4. Reduktionsreaktionen der pQ3ß-HSD 124
D1.2Cosubstratspezifität 127
D 1.3 Inhibierung durch zweiwertige Metallionen 128
D 1.4 pH-Optimum und isoelektrischer Punkt 128
D 1.5 Temperaturoptimum 129
D 1.6 Enzymkinetik 130
D 1.7 Untersuchungen der pQ3ß-HSD bezüglich Ketosteroidisomeraseaktivität
132
D2 Native 3ß-HSD aus Erysimum crepidifolium 138
D 2.1 Vorversuche zur Reinigung der Ecre3ß-HSD 138
D 2.1.1 Vorversuche mit Pregnenolon und 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 140
D 2.2 pH-Optimum 142
D 2.3 Stabilität 143
D 2.4 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium - Suspensionskultur
143
D 2.5 Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus £. crepidifolium - Blattmaterial 145
D 2.6 Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 148
E Zusammenfassung 151
ESummary 152
F Literaturverzeichnis 153
G Anhang 161
G 1. Abkürzungsverzeichnis 161
G2. Abbildungsverzeichnis 162
G 3. Tabellenverzeichnis 166
G4. Publikationsliste 167
Anhang
G 2. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Gemeinsame Zuckerkomponenten der herzwirksamen Glykoside aus
Erysimum und Digitalis 5
Abbildung 2 Postulierter Biosyntheseweg des Cardenolidgrundgerüstes in Digitalis.»
Abbildung 3 Reaktionsmechanismus der tierischen 3ß-HSD am Beispiel von
Pregnenolon als Substrat 11
Abbildung 4 DC des Aktivitätstests pQ3ß-HSD mit unterschiedlichen
Proteinkonzentrationen und Inkubationszeiten 40
Abbildung 5 Getestete Substrate der pQ3ß-HSD 42
Abbildung 6 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3ß-ol-20-on als
Substrat 43
Abbildung 7 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als
Substrat 44
Abbildung 8 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 21-OH-Pregnenolon als Substrat.
44
Abbildung 9 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5-Androsten-3ß-ol-17-on als
Substrat 45
Abbildung 10 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Xysmalogenin als Substrat 45
Abbildung 11 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Digitoxigenin als Substrat 46
Abbildung 12 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Cholesterol als Substrat 46
Abbildung 13 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3a-ol-20-on als
Substrat 47
Abbildung 14 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3a-ol-20-on als
Substrat 48
Abbildung 15 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Testosteron als Substrat 48
Abbildung 16 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3,20-dion als
Substrat 49
Abbildung 17 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3,20-dion als
Substrat 50
Abbildung 18 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Progesteron als Substrat 50
Abbildung 19 DC der Reaktion von pQ3ß-HSD mit4-Androsten-3,17-dion als
Substrat 51
Abbildung 20 Diagramm des Stabilitätstests bei 4 'C. Die spezifische Aktivität pQ3ß-
HSD an verschiedenen Tagen 53
Abbildung 21 Diagramm der pH-Optimum-Bestimmung der pQ3ß-HSD für die
Oxidationsreaktion 54
Abbildung 22 Diagramm der pH-Optimum-Bestimmung der pQ3ß-HSD für die
Reduktionsreaktion 55
Abbildung 23 Diagramm der Bestimmung des Temperaturoptimums der
Oxidationsreaktion von pQ3ß-HSD 56
Abbildung 24 Diagramm der Bestimmung des Temperaturoptimums der
Reduktionsreaktion von pQ3ß-HSD 57
Abbildung 25 Diagramm des Einflusses zweiwertiger Metallionen auf die Aktivität
derpQ3ß-HSD 57
Abbildung 26 lEF-Gel der pQ3ß-HSD nach Silberfärbung 58
Abbildung 27 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Pregnenolon als
Substrat und Hanes-Plot 60
Abbildung 28 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-
20-on als Substrat und Hanes-Plot 60
162
Anhang
Abbildung 29 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3ß-ol-
20-on als Substrat und Hanes-Plot 61
Abbildung 30 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Androstenolon als
Substrat und Hanes-Plot 61
Abbildung 31 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Testosteron als
Substrat und Hanes-Plot 62
Abbildung 32 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3,20-
dion als Substrat und Hanes-Plot 63
Abbildung 33 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit 5a-Pregnan-3,20-
dion als Substrat und Hanes-Plot 63
Abbildung 34 HPLC-Spektrum der Reaktion von pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als
Substrat und Hanes-Plot 64
Abbildung 35 Hanes-Auftragung von NAD 65
Abbildung 36 Hanes-Auftragung von NADH 65
Abbildung 37 Diagramm des Vergleiches von pQ3ß-HSD mit Rohextrakt (RE) von
Digitalis lanata 67
Abbildung 38 Diagramm der Ketosteroidisomeraseaktivität und Autoisomerisierung
in D. lanata bei verschiedenen Proteinkonzentrationen 69
Abbildung 39 Diagramm der Zeitkinetik mit Isoprogesteron als Substrat bei 37 'C
(KSI-Bedingungen) 70
Abbildung 40 Diagramm der Zeitkinetik pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als Substrat
bei 50 "C (3ß-HSD-Bedingungen) 70
Abbildung 41 Diagramm der Untersuchung von pQ3ß-HSD auf KSI-Aktivität mit
verschiedenen Substraten 72
Abbildung 42 Diagramm der Zeitkinetik pQ3ß-HSD mit Isoprogesteron als Substrat
und verschiedenen Cosubstraten 73
Abbildung 43 DC der Reaktion der Negativkontrolle (endogene Bakterienenzyme)
mit 5ß-Pregnan-3,20-dion und 5ß-Pregnan-3a-ol-20-on als Substrate 74
Abbildung 44 Diagramm der Reaktion der Negativkontrollen (endogene
Bakterienenzyme) der Substrate Isoprogesteron und Testosteron verglichen mit
der Reaktion von pQ3ß-HSD 75
Abbildung 45 DC des Aktivitätstests von Eall3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat.
77
Abbildung 46 DC des Aktivitätstests von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat.
77
Abbildung 47 DC der in E. crepidifolium enthaltenen herzwirksamen Glykoside 78
Abbildung 48 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei
verschiedenen Proteinkonzentrationen und Inkubation über Nacht 79
Abbildung 49 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei
verschiedenen Inkubationszeiten und gleich bleibender Proteinkonzentration. .80
Abbildung 50 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat bei
25 - 70%iger Ammoniumsulfatfällung 81
Abbildung 51 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat zur
Untersuchung der Salzabhängigkeit. 82
Abbildung 52 Bestimmung der Aktivität mit NaPi pH 6,0 - 7,8 bei 2,5 h lnkubation.83
Abbildung 53 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon als Substrat im
Extraktionspuffervergleich bei 2 h Inkubation 84
Abbildung 54 Thermische Behandlung des Rohextraktes von E. crepidifolium 85
Abbildung 55 Diagramm zur Bestimmung des Einflusses des Proteingehalts auf die
Aktivität für Ecre3ß-HSD 86
163
Anhang
Abbildung 56 Diagramm zur Ermittlung des linearen Bereiches der Enzymaktivität in
Abhängigkeit von der Inkubationszeit für Ecre3ß-HSD 87
Abbildung 57 DC der Reaktionen von Ecre3ß-HSD mit Pregnenolon und
Testosteron als Substrate 88
Abbildung 58 DC der Reaktionen von Ecre3ß-HSD mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on und
5ß-Pregnan-3,20-dion als Substrate 89
Abbildung 59 Diagramm zur Ermittlung des pH-Optimums der Ecre3ß-HSD mit
Pregnenolon als Substrat 90
Abbildung 60 Diagramm zur Ermittlung des pH-Optimums der Ecre3ß-HSD mit 5ß-
Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 91
Abbildung 61 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die Substrate
Pregnenolon und 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on an Tag 0 der Stabilitätsprüfung mit
verschiedenen Pufferzusätzen 92
Abbildung 62 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die
Stabilitätsprüfung mit Pregnenolon als Substrat 93
Abbildung 63 Diagramm der spezifischen Aktivität der Ecre3ß-HSD für die
Stabilitätsprüfung mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on als Substrat 93
Abbildung 64 Elutionsprofil an Phenylsepharose 6FF mit 0,8M (NH4 2SO4 95
Abbildung 65 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß-
HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 95
Abbildung 66 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an Phenylsepharose 6FF mit 0.75M
(NH4)2SO4 96
Abbildung 67 Diagramm der Aktivität der Ecre3ß-HSD1 vor und nach
Säulenchromatographie an Phenylsepharose 6FF 96
Abbildung 68 Elutionsprofil an SP Sepharose Fast Flow mit 0,5 M NaCI 97
Abbildung 69 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß-
HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 98
Abbildung 70 Elutionsprofil an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI 99
Abbildung 71 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß-
HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 99
Abbildung 72 Elutionsprofil an Source 30Q mit 0,5 M NaCI 100
Abbildung 73 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon und von Ecre3ß-
HSD2 mit 5ß-Pregnan-3ß-ol-20-on 101
Abbildung 74 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung der Ecre3ß-HSD1 aus dem
Proteinrohextrakt bei Reinigung 1 102
Abbildung 75 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an SP Sepharose Fast Flow mit 0,5 M
NaCI bei Reinigung 1 104
Abbildung 76 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach
Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow bei Reinigung
1 104
Abbildung 77 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI bei
Reinigung 1 105
Abbildung 78 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach
Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP bei Reinigung 1 106
Abbildung 79 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Affinitätschromatographie an
HiTrap Blue HP bei Reinigung 1 107
Abbildung 80 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung der Ecre3ß-HSD1 aus dem
Proteinrohextrakt bei Reinigung 2 109
Abbildung 81 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an SP Sepharose Fast Flow mit 0.5 M
NaCI Reinigung 2 111
164
Anhang
Abbildung 82 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach
Kationenaustauschchromatographie an SP Sepharose Fast Flow Reinigung 2,
111
Abbildung 83 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an HiTrap Blue HP mit 0,5 M NaCI
Reinigung 2 112
Abbildung 84 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach
Affinitätschromatographie an HiTrap Blue HP Reinigung 2 113
Abbildung 85 Elutionsprofil der Ecre3ß-HSD1 an Superdex 75 114
Abbildung 86 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach Gelfiltration
an Superdex 75 115
Abbildung 87 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Affinitätschromatographie an
HiTrap Blue HP bei Reinigung 2 116
Abbildung 88 Silbergefärbtes 10%iges SDS-Gel nach Gelfiltration an Superdex 75.
116
Abbildung 89 DC der Reaktion von Ecre3ß-HSD1 mit Pregnenolon nach
Stabilitätsprüfung bei-20 "C 118
Abbildung 90 DC der Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 mit
Pregnenolon und Isoprogesteron als Substrate 119
Abbildung 91 DC der Substratspezifität der teilgereinigten Ecre3ß-HSD1 mit 5ß-
Pregnan-3,20-dion und Testosteron als Substrate 120
Abbildung 92 Strukturmerkmale untersuchter Substrate 121
Abbildung 93 Zusammenspiel von 3a-HSD und 5a-Reduktase in der Ratte (nach
Wiebe et al., 1994) 125
Abbildung 94 Allgemeiner Mechanismus der nicht-enzymatischen Isomerisierung
nach Houck und Pollack (2003) 135
Abbildung 95 Reaktionsmechanismus der Ketosteroidisomerase nach Pollack
(2004) 136
165
Anhang
G 3. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Ausgewählte cardenolidführende Pflanzenfamilien und ihre Vertreter nach
Hansel und Sticher (2004) 1
Tabelle 2: Inhaltsstoffgruppen der Gattungen Digitalis und Erysimum neben den
Cardenoliden 3
Tabelle 3: Cardenolidgrundgerüst und die in den Gattungen Digitalis und Erysimum
vorkommenden Aglyka, abgewandelt nach Luckner und Wichtl (2000) 4
Tabelle 4: Hauptcardenolide in E. crepidifolium 7
Tabelle 5: Aktivität mit verschiedenen Cosubstraten 52
Tabelle 6: Km- und VmarWerte pQ3ß-HSD 66
Tabelle 7: Bilanz der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus Suspensionskultur von E.
crepidifolium 108
Tabelle 8: Bilanz der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus Blattmaterial von E.
crepidifolium 117
Tabelle 9: Enzyme für die Umwandlung von 5a- und 5ß-Pregnanen in Digitalis. 125
Tabelle 10: Temperaturoptima der Hydroxysteroid-Oxidoreduktasen aus D/g/ta/Js.130
Tabelle 11: Substrate der pQ3ß-HSD und ihre kinetischen Konstanten im Vergleich
mit den von Finsterbusch et al. (1999) bestimmten Parameter 131
Tabelle 12: Vergleich der Reinigung der Ecre3ß-HSD1 aus E. crepidifolium
Suspensionskultur und Blattmaterial 146
Tabelle 13: Gegenüberstellung einiger Eigenschaften der Ecre3ß-HSD1 und Dlan3ß-
HSD (Finsterbusch, 1999) 150
166 |
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