Zelladhäsion auf Modelloberflächen:
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2008
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 8
2 EINLEITUNG 10
2.1 Biomaterialien 10
2.2 Biokompatibilität 12
2.3 Biohinktionalisierung durch Variation der Oberflächentopographie 13
2.4 Biofunküonalisiening durch selbstorganisierende Monoschichten auf Modelloberflächen 14
2.5 Mechanismus der Bioadhäsion 15
2.6 Komponenten der extrazellulären Matrix 17
2.7 Mechanismus der Zelladhäsion 19
2.8 Biofunktionalisierung von SAMs durch Proteine 21
3 MATERIAL UND METHODEN 23
3.1 Material 23
3.1.1 Zelllinie 23
3.1.2 Verbrauchsmaterial und Geräte 23
3.1.2.1 Verbrauchsmaterialien 23
3.1.2.2 Gerate 24
3.1.2.3 Lösungen, Chemikalien und Reagenzien 25
3.1.3 Software 29
3.2 Methoden 30
3.2.1 Silizium-Wafer mit modifizierten Oberflachen 30
3.2.2 Charakterisierung der Waferoberflache im Rasterelektronenmikroskop 32
3.2.3 Ablauf der Netzwinkelbestimmung 32
3.2.4 Netzwinkelbestimmung aller verwendeten Oberflächen zur Zellaussaat 33
3.2.5 Verfahren mit der Zellkultur 35
3.2.6 Zelladhasion von MG63-Zellen an Modelloberflächen im Elektronenmikroskop 35
32 7 Proliferation von MG63-Zellen auf Modelloberflachen 37
3.2.8 Synchronisierung des Zellzyklus einer Zellpopulation in einer Routinekultur 40
329 Exposition von MG63-Zellen an Modelloberflachen zur Zellzyklusanalyse 40
3.2.10 Analyse des Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie 44
3.2.10.1 Prinzip und DNA-Farbstoff 44
3.2.10.2 Vorbereitung der Proben 44
3 2 10 3 Funktionsweise der durchflusszytomerrischen Messtechnik 45
3.2.10.4 Bestimmung des DNA-Gehalts mittels Durchflusszytometrie 46
3.2.10.5 Datenverarbeitung und Darstellung 47
3 2 10 6 Konvertieren und Gaten von Cell Quest list-mode Daten in expo 32 ADC Analysis 49
3 2.10.7 Zellzyklusanalyse einer Zellpopulation mittels WinCycle für Windows 49
3.2.11 Analyse und Auswertung der gesammelten Daten 50
4 FRAGESTELLUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT 51
5 ERGEBNISSE 52
5.1 Charakterisierung hergestellter Wafer im REM 52
5.2 Netzwinkel der Modelloberflächen mit Wasser 58
5.3 Morphologische Charakterisierung von MG63 Osteoblasten auf Modelloberfläcben 61
5.4 Zellproliferation auf Modelloberflächen 63
5.5 Charakterisierung des Zellzyklus von MG63 Osteoblasten in der standardisierten
Routinekultur 67
5.6 Analyse des Zellzyklus von MG63 Osteoblasten auf Modelloberflächen 69
6 DISKUSSION 77
6.1 Herstellung und Charakterisierung der Modelloberflächen 78
6.1.1 Zur Herstellung zweier Modelloberflächen 78
6.1.2 Bestimmung der Hydrophilie der getesteten Oberflachen 79
6.1.3 Beschichtung der Oberflächen mit Fibronektin 81
6.2 Der Einfluss von Modelloberflächen auf die Zellproliferation und den Zellzyklus 82
6.2.1 Der Einfluss von Modelloberflächen auf die Zellproliferation 83
6.2.2 Der Einfluss von Modelloberflächen auf den Zellzyklus. 87
7 ZUSAMMENFASSUNG 90
8 QUELLENVERZEICHNIS 93
9 DANKSAGUNG 102
10 LEBENSLAUF 103
1 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Strukturformel von HFS 15
Abbildung 2: Proteinvermittelte Zelladhäsion auf hydrophilen und hydrophoben
Modelloberflächen 16
Abbildung 3: Schematische Struktur des Fibronektins 17
Abbildung 4: Struktur einer Kette des Fibronektins 18
Abbildung 5: Intra- und extrazellulärer Anteil des Integrins 19
Abbildung 6: Funktion von Transmembranproteinen 20
Abbildung 7: REM-Bilder des Adhäsionsvorgangs von Zellen auf
Modelloberflächen mit kovalent gebundenem Protein, das eine
RGD-Sequenz beinhaltet 21
Abbildung 8: Blick durch das Goniometer auf einen der HFS Oberfläche
adhärierten Wassertropfen des standardisierten Volumens 2ul 33
Abbildung 9: Versuchsanordnung zur Bestimmung der Netzwinkel aller
verwendeten Modelloberflächen 34
Abbildung 10: Versuchsschema zur Charakterisierung von MG63-Zellen auf
Modelloberflächen 36
Abbildung 11: Versuchsschema je Inkubationsdauer von 24 und 48 Stunden zur
Analyse der Zellproliferation 37
Abbildung 12: Versuchsschema zur Zellzyklusanalyse von MG63-Zellen auf
Modelloberflächen bei Zellaussaat von 1,25 x 104 Zellen pro cm2 41
Abbildung 13: Versuchsschema zur Zellzyklusanalyse von MG63-Zellen auf
Modelloberflächen bei Zellaussaat von 2,5 x 104 Zellen pro cm2 42
Abbildung 14: Schematischer Aufbau des Durchflusszytometers 46
Abbildung 15: Gating in einer Dot-Plot Darstellung 48
Abbildung 16: Histogramm einer Zellzyklusanalyse 48
Abbildung 17: lern2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp I im
Rasterelektronenmikroskop 52
Abbildung 18: 5,29cm2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp I im
Rasterelektronenmikroskop 53
Abbildung 19: lern2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp II im
Rasterelektronenmikroskop 54
8
Abbildung 20: 5,29cm2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp II im
Rasterelektronenmikroskop 55
Abbildung 21: 1 cm2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp III im
Rasterelektronenmikroskop 56
Abbildung 22: 5,29cm2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp III im
Rasterelektronenmikroskop 57
Abbildung 23: Kontaktwinkel der unterschiedlichen Modelloberflächen mit Wasser 58
Abbildung 24: Unterschiedliche Zelldichte von MG63-Zellen auf SiOH-Wafern 61
Abbildung 25: MG63-Zellen auf HFS-Wafern 62
Abbildung 26: Morphologie von MG63-Zellen auf SiOH-Wafern mit und ohne
Fibronektin 63
Abbildung 27: Zellproliferation auf Modelloberflächen nach Auasaat von 2,5xlO4
Zellen pro Well 65
Abbildung 28: Zellproliferation auf Modelloberflächen nach Auasaat von 5xlO4
Zellen pro Well 66
Abbildung 29: Mikroskopische Betrachtung einer standardisierten Routinekultur 68
Abbildung 30: Zellzyklusanalyse der standardisierten Routinekultuen 69
Abbildung 31: Anteil der MG63-Zellen in der Gl-Phase des Zellzyklus 72
Abbildung 32: Anteil der MG63-Zellen in der S-Phase des Zellzyklus 72
Abbildung 33: Anteil der MG63-Zellen mit doppeltem Chromosomensatz, also in
G2-Phase des Zellzyklus . 73
Abbildung 34: Anteile der MG63-Zellen mit einfachem Chromosomensatz, also in
G1 -Phase des Zellzyklus der beiden Versuche mit den verschiedenen
ausgebrachten Zellzahlen 75
Abbildung 35: Anteile der MG63-Zellen in S-Phase des Zellzyklus aus beiden
Versuchen mit den verschiedenen ausgebrachten Zellzahlen 76
Abbildung 36: Anteile der MG63-Zellen in G2-Phase (also mit doppeltem
Chromosomensatz) des Zellzyklus aus beiden Versuchen mit den
verschiedenen ausgebrachten Zellzahlen 76
9
|
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Inhaltsverzeichnis
1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 8
2 EINLEITUNG 10
2.1 Biomaterialien 10
2.2 Biokompatibilität 12
2.3 Biohinktionalisierung durch Variation der Oberflächentopographie 13
2.4 Biofunküonalisiening durch selbstorganisierende Monoschichten auf Modelloberflächen 14
2.5 Mechanismus der Bioadhäsion 15
2.6 Komponenten der extrazellulären Matrix 17
2.7 Mechanismus der Zelladhäsion 19
2.8 Biofunktionalisierung von SAMs durch Proteine 21
3 MATERIAL UND METHODEN 23
3.1 Material 23
3.1.1 Zelllinie 23
3.1.2 Verbrauchsmaterial und Geräte 23
3.1.2.1 Verbrauchsmaterialien 23
3.1.2.2 Gerate 24
3.1.2.3 Lösungen, Chemikalien und Reagenzien 25
3.1.3 Software 29
3.2 Methoden 30
3.2.1 Silizium-Wafer mit modifizierten Oberflachen 30
3.2.2 Charakterisierung der Waferoberflache im Rasterelektronenmikroskop 32
3.2.3 Ablauf der Netzwinkelbestimmung 32
3.2.4 Netzwinkelbestimmung aller verwendeten Oberflächen zur Zellaussaat 33
3.2.5 Verfahren mit der Zellkultur 35
3.2.6 Zelladhasion von MG63-Zellen an Modelloberflächen im Elektronenmikroskop 35
32 7 Proliferation von MG63-Zellen auf Modelloberflachen 37
3.2.8 Synchronisierung des Zellzyklus einer Zellpopulation in einer Routinekultur 40
329 Exposition von MG63-Zellen an Modelloberflachen zur Zellzyklusanalyse 40
3.2.10 Analyse des Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie 44
3.2.10.1 Prinzip und DNA-Farbstoff 44
3.2.10.2 Vorbereitung der Proben 44
3 2 10 3 Funktionsweise der durchflusszytomerrischen Messtechnik 45
3.2.10.4 Bestimmung des DNA-Gehalts mittels Durchflusszytometrie 46
3.2.10.5 Datenverarbeitung und Darstellung 47
3 2 10 6 Konvertieren und Gaten von Cell Quest list-mode Daten in expo 32 ADC Analysis 49
3 2.10.7 Zellzyklusanalyse einer Zellpopulation mittels WinCycle für Windows 49
3.2.11 Analyse und Auswertung der gesammelten Daten 50
4 FRAGESTELLUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT 51
5 ERGEBNISSE 52
5.1 Charakterisierung hergestellter Wafer im REM 52
5.2 Netzwinkel der Modelloberflächen mit Wasser 58
5.3 Morphologische Charakterisierung von MG63 Osteoblasten auf Modelloberfläcben 61
5.4 Zellproliferation auf Modelloberflächen 63
5.5 Charakterisierung des Zellzyklus von MG63 Osteoblasten in der standardisierten
Routinekultur 67
5.6 Analyse des Zellzyklus von MG63 Osteoblasten auf Modelloberflächen 69
6 DISKUSSION 77
6.1 Herstellung und Charakterisierung der Modelloberflächen 78
6.1.1 Zur Herstellung zweier Modelloberflächen 78
6.1.2 Bestimmung der Hydrophilie der getesteten Oberflachen 79
6.1.3 Beschichtung der Oberflächen mit Fibronektin 81
6.2 Der Einfluss von Modelloberflächen auf die Zellproliferation und den Zellzyklus 82
6.2.1 Der Einfluss von Modelloberflächen auf die Zellproliferation 83
6.2.2 Der Einfluss von Modelloberflächen auf den Zellzyklus. 87
7 ZUSAMMENFASSUNG 90
8 QUELLENVERZEICHNIS 93
9 DANKSAGUNG 102
10 LEBENSLAUF 103
1 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Strukturformel von HFS 15
Abbildung 2: Proteinvermittelte Zelladhäsion auf hydrophilen und hydrophoben
Modelloberflächen 16
Abbildung 3: Schematische Struktur des Fibronektins 17
Abbildung 4: Struktur einer Kette des Fibronektins 18
Abbildung 5: Intra- und extrazellulärer Anteil des Integrins 19
Abbildung 6: Funktion von Transmembranproteinen 20
Abbildung 7: REM-Bilder des Adhäsionsvorgangs von Zellen auf
Modelloberflächen mit kovalent gebundenem Protein, das eine
RGD-Sequenz beinhaltet 21
Abbildung 8: Blick durch das Goniometer auf einen der HFS Oberfläche
adhärierten Wassertropfen des standardisierten Volumens 2ul 33
Abbildung 9: Versuchsanordnung zur Bestimmung der Netzwinkel aller
verwendeten Modelloberflächen 34
Abbildung 10: Versuchsschema zur Charakterisierung von MG63-Zellen auf
Modelloberflächen 36
Abbildung 11: Versuchsschema je Inkubationsdauer von 24 und 48 Stunden zur
Analyse der Zellproliferation 37
Abbildung 12: Versuchsschema zur Zellzyklusanalyse von MG63-Zellen auf
Modelloberflächen bei Zellaussaat von 1,25 x 104 Zellen pro cm2 41
Abbildung 13: Versuchsschema zur Zellzyklusanalyse von MG63-Zellen auf
Modelloberflächen bei Zellaussaat von 2,5 x 104 Zellen pro cm2 42
Abbildung 14: Schematischer Aufbau des Durchflusszytometers 46
Abbildung 15: Gating in einer Dot-Plot Darstellung 48
Abbildung 16: Histogramm einer Zellzyklusanalyse 48
Abbildung 17: lern2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp I im
Rasterelektronenmikroskop 52
Abbildung 18: 5,29cm2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp I im
Rasterelektronenmikroskop 53
Abbildung 19: lern2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp II im
Rasterelektronenmikroskop 54
8
Abbildung 20: 5,29cm2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp II im
Rasterelektronenmikroskop 55
Abbildung 21: 1 cm2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp III im
Rasterelektronenmikroskop 56
Abbildung 22: 5,29cm2 HFS-Wafer nach Herstellungstyp III im
Rasterelektronenmikroskop 57
Abbildung 23: Kontaktwinkel der unterschiedlichen Modelloberflächen mit Wasser 58
Abbildung 24: Unterschiedliche Zelldichte von MG63-Zellen auf SiOH-Wafern 61
Abbildung 25: MG63-Zellen auf HFS-Wafern 62
Abbildung 26: Morphologie von MG63-Zellen auf SiOH-Wafern mit und ohne
Fibronektin 63
Abbildung 27: Zellproliferation auf Modelloberflächen nach Auasaat von 2,5xlO4
Zellen pro Well 65
Abbildung 28: Zellproliferation auf Modelloberflächen nach Auasaat von 5xlO4
Zellen pro Well 66
Abbildung 29: Mikroskopische Betrachtung einer standardisierten Routinekultur 68
Abbildung 30: Zellzyklusanalyse der standardisierten Routinekultuen 69
Abbildung 31: Anteil der MG63-Zellen in der Gl-Phase des Zellzyklus 72
Abbildung 32: Anteil der MG63-Zellen in der S-Phase des Zellzyklus 72
Abbildung 33: Anteil der MG63-Zellen mit doppeltem Chromosomensatz, also in
G2-Phase des Zellzyklus '. 73
Abbildung 34: Anteile der MG63-Zellen mit einfachem Chromosomensatz, also in
G1 -Phase des Zellzyklus der beiden Versuche mit den verschiedenen
ausgebrachten Zellzahlen 75
Abbildung 35: Anteile der MG63-Zellen in S-Phase des Zellzyklus aus beiden
Versuchen mit den verschiedenen ausgebrachten Zellzahlen 76
Abbildung 36: Anteile der MG63-Zellen in G2-Phase (also mit doppeltem
Chromosomensatz) des Zellzyklus aus beiden Versuchen mit den
verschiedenen ausgebrachten Zellzahlen 76
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