Etablierung eines QCM basierten Verfahrens zur Bestimmung von Antikörperaffinitäten und der Charakterisierung des Bindungsverhaltens mono- und polyklonaler Anti-HBs aus Patientenseren mit HBs - Antigen und ausgewählten Mutationen des HBs-Antigens:
Gespeichert in:
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2008
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adam_text | Inhaltsverzeichnis
Danksagung II
Inhaltsverzeichnis III
Zusammenfassung IV
1. Einleitung 1
1.1 Weltweite Bedeutung von HBV l
1.2 Aufbau des HB Virus und Replikationszyklus l
1.3 Zentrale Rolle der HBs-Antigen-Anti-HBs Interaktion 3
1.4 Bedeutung von Mutationen des HBs Antigens 4
1.5 Funktionsprinzip des AFFCo 2000 5
2. Material und Methoden 2
2.1 Material 7
2.1.1 Chemikalien und Biochemikalien 7
2.1.2 Puffer und Lösungen 8
2.1.3 Nährmedien 11
2.1.4 Kits 12
2.1.5 Enzyme 13
2.1.6 Oligonukleotide 13
2.1.7 Organismen 14
2.1.8 Seren 15
2.1.9 Antikörper 15
2.1.10 Antigene 15
2.2 Methoden 17
2.2.1 Arbeit mit Bakterien 17
2.2.1.1 Flüssigkulturen 17
2.2.1.2 Plattenkulturen 17
2.2.1.3 Glycerinkulturen 17
2.2.1.4 Microbanksystem 18
2.2.2. Techniken zur Arbeit mit DNS 18
2.2.2.i.Isolierung von DNS Fragmenten aus Agarosegelen 18
2.2.2.2 Reinigung von DNS Fragmenten über Qia Säulchen 19
2.2.2.3 Enzymatische Spaltung von DNS Fragmenten mit
Restriktionsendonukleasen 19
2.2.2.4 Präparative Spaltung von DNS für Klonierungen 19
2.2.2.5 Dephosphorylierung von DNS Fragmenten 19
2.2.2.6 T4 DNS Polymerasebehandlung von PCR Produkten. 20
2.2.2.7 Phosphorylierung von DNS Fragmenten 20
2.2.2.8 Umklonierung des Polylinkers eines Transfektionsvectors 20
2.2.2.9 Blunt-End-Ügation 21
2.2.2.10 Transformation von DNS in kompetente Bakterien 21
2.2.2.H Identifizierung und Charakterisierung von rekomb. Bakterienklonen 22
2.2.2.12 Isolierung von DNS durch alkalische Schnelllyse 22
2.2.2.13 Isolierung von DNA mit dem Qia Maxi Kit 23
2.2.2.14 Isolierung von gesamtgenomischer zellulärer DNS 24
2.2.2.15 Agarose - Gelelektrophorese 24
2.2.2.16 Polymerase - Kettenreaktion 24
2.2.2.16.1 Herstellung von Primerpaaren für die PCR 25
2.2.2.16.2 PCR Ansatz 26
2.2.2.16.3 Verwendete PCR Programme 26
2.2.2.17 Southernblot 26
2.2.2.17.1 Herstellung von Sonden für den Southernblot 26
2.2.2.17.2 Durchführen des Blots 27
2.2.2.18 Colonylift 28
2.2.2.19 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNS 28
2.2.2.20 DNS Sequenzierung 29
2.2.3 Zellkulturtechniken 30
2.2.3.1 Herstellung von Medien 30
2.2.3.1.1 MEM10 und MEM2,5 30
2.2.3.1.2 Einfriermedium 30
2.2.3.1.3 Plaquemedium 30
2.2.3.1.4 VTT Selektionsmedium 30
2.2.3.1.5 Inaktivierung von FCS 30
2.2.3.2 Auftauen von Zellen 31
2.2.3.3 Kultivierung von Zellen als Monolayerkulturen 31
2.2.3.4 Lagerung von Zellen 31
2.2.3.5 Bestimmung der Zellzahl 31
2.2.4 Arbeit mit Vacciniaviren 32
2.2.4.1 Auftauen von Vacciniaviren 32
2.2.4.2 Lagerung von Vacciniaviren 32
2.2.4.3 Infektion von Zellen mit Vacciniaviren 32
2.2.4.4 Produktion eines Vacciniavirus Wildtyp Stock 32
2.2.4.5 Infektion von Zellen für die Transfektion 33
2.2.4.6 Produktion von Vacciniavirus 33
2.2.4.7 Titerbestimmung eines VTT Stockes 33
2.2.?; Herstellung rekombinanter Vacciniaviren 34
2.2.5.1 Transfektion 34
2.2.5.2 Selektion und Screening rekombinanter Virusplaques 36
2.2.5.3 Reinigung 38
2.2.5.4 Amplifikation 38
2.2.5.5 Viruskontrolle 39
2.2.5.6 Produktion von Vacciniavirus 4°
2.2.6 Produktion von HBs-Antigen in der Zellkultur durch rekombinante
Vacciniaviren 4°
2.2.6.1 Produktion 40
2.2.6.2 Aufreinigung durch Ultrafiltration 4*
2.2.6.3 Aufreinigung durch präparative Gelfiltration 41
2.2.6.4 Titerbestimmung und Lagerung 4*
2.2.7 Isolierung von Anti HBs aus human Seren 42
2.2.7.1 Isolierung von Anti HBs mit MAP-Trap™ 42
2.2.7.2 Konzentrationsbestimmung von Anti HBs 43
2.2.7.3 Lagerung von Anti HBs 44
2.2.8 AFFco 2000 Biosensor 44
2.2.8.1 Historische Entwicklung und allgemeines Funktionsprinzip 44
2.2.8.2 Auswahl der Messmethode 45
2.2.8.3 Auswahl und Vorbereitung des Laufpuffers und der Analytlösungen 46
2.2.8.4 Beschichtung der Quarze 48
2.2.8.5 Standardisierung der Messbedingungen 49
2.2.8.6 Abblocken unspezifischer Bindungen 50
2.2.8.7 Messablauf am Biosensor 51
2.2.8.8 Auswertung der Frequenzkurven 52
2.2.8.9 Entstehung einer Frequenzbindungskurve 52
3. Ergebnisse 57
3.1 Produktion von HBs Antigen mit Hilfe rekombinanter Vacciniaviren 57
3.1.1 Herstellung der HBs-Antigen-Mutanten R145, Q141 und M125 mit Hilfe
rekombinanter Vacciniaviren. 58
3.1.2 Produktion von HBs-Antigen mit Hilfe von rekombinanten Vacciniaviren 59
3.2 Etablierung eines Messverfahrens am AFFCo 2000 zur Vermessung
von HBs-Antigen mit poly- und monoklonalen Anti-HBs. 61
3.2.1 Demonstration spezifischer Anti-HBs — HBs-Antigen -Interaktionen mit
dem AFFCo 2000 62
3.2.2 Vergleich verschiedener Testverfahren 63
3.2.3 Analyse von Einflussfaktoren und Standardisierung der
Messbedingungen. 66
3.2.3.1 Einfluss gerätespezifischer Faktoren 66
3.2.3.2 Absättigung unspezifischer Bindungsstellen 70
3.2.3.3 Einfluss der Dispersion auf das Bindungssignal 72
3.2.3.3.1 Reduktion des Einflusses der Viskosität auf die
Frequenzkurven des Biosensors 74
3.2.3.3.2 Relation von Viskositäts- und Bindungssignal 77
3.2.3.3.3 Reduktion des Einflusses der Dispersion durch die
Wahl der Auswerteareale 79
3.2.3.3.4 Streckenlänge der Auswertung 81
3.2.4 Messgenauigkeit und Reproduzierbarkeit der Antigenbeschichtung 85
3.2.4.1 Konzentrationsabhängigkeit des Frequenzabfalles 85
3.2.4.2 Bestimmung der Anzahl an gebundenen Antikörpern 85
3.2.4.3 Bestimmung der KD durch Mehrfachmessungen 86
3.2.e; Zusammenfassung der Ergebnisse zur Etablierung des
Messverfahrens am Biosensor 89
3.3 Messung von Anti-HBs - HBs-AntJgen Affinitäten mit dem
AFFCo 2000 8a
3.3.1 Das Bindungsverhalten von poly- und monoklonalen Antikörpern
gegenüber HBs-Antigen von GSK 90
3.3.2 Das Bindungsverhalten von poly- und monoklonalen Antikörperisolaten
gegenüber verschiedenen Antigenen 95
3.4 Zusammenfassung: 110
4. Diskussion 111
4.1 Weltweite Bedeutung von HBV und zentrale Rolle der
HBs-Antigen — Anti-HBs-Interaktion 111
4.2 Der AFFCo 2000 ist ein anerkanntes Messverfahren für die
Charakterisierung von Anlägen — Antikörper — Affinitäten 112
4.2.1 Herstellung einer spezifischen Beschichtung der Messquarze 113
4.2.2 Effektive Äbsättigung unspezifischer Bindungsstellen durch
HBs-Antigen- und Anti-HBs-freies Humanserum. 114
4.2.3 Die spezifische Messung von Anti-HBs - HBs-Antigen - Affinitäten 115
4.3 Auswahl der Antigenbeschichtung 115
4.4 Reproduzierbarkeit und Reliabilität der Messungen H7
4.4.1 Standardisierbarkeit der Messbedingungen 117
4.4.2 Etablierung einer verlässlichen Auswertung 118
4.4.3 Reproduzierbarkeit 120
4.4.4 Vermessung monoklonaler Antikörper 125
4.5 Vermessung von Anti-HBs - HBs Antigen Affinitäten geimpfter
Erwachsener J^Z
4.5.1 Besonderheiten bei der Vermessung polyklonaler Antikörper 127
4.5.2 Vermessung polyklonaler Antikörper mit dem HBs-Antigen 128
4» 6 Vermessung von HBs-Antigen Mutanten mit poly- und monoklonalen
Anti-HBs 12Q
4.6.1 Auswahl des Produktionsverfahrens 130
4.6.2 Auswahl der Mutanten 130
4.6.3 Vermessung der HBs Antigen Mutanten 133
4.7 Zusammenfassung 135
x. Literaturverzeichnis 136
6. Abkürzungsverzeichnis 14.Q
7.Eidesstattliche Erklärung 152
|
adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Danksagung II
Inhaltsverzeichnis III
Zusammenfassung IV
1. Einleitung 1
1.1 Weltweite Bedeutung von HBV l
1.2 Aufbau des HB Virus und Replikationszyklus l
1.3 Zentrale Rolle der HBs-Antigen-Anti-HBs Interaktion 3
1.4 Bedeutung von Mutationen des HBs Antigens 4
1.5 Funktionsprinzip des AFFCo 2000 5
2. Material und Methoden 2
2.1 Material 7
2.1.1 Chemikalien und Biochemikalien 7
2.1.2 Puffer und Lösungen 8
2.1.3 Nährmedien 11
2.1.4 Kits 12
2.1.5 Enzyme 13
2.1.6 Oligonukleotide 13
2.1.7 Organismen 14
2.1.8 Seren 15
2.1.9 Antikörper 15
2.1.10 Antigene 15
2.2 Methoden 17
2.2.1 Arbeit mit Bakterien 17
2.2.1.1 Flüssigkulturen 17
2.2.1.2 Plattenkulturen 17
2.2.1.3 Glycerinkulturen 17
2.2.1.4 Microbanksystem 18
2.2.2. Techniken zur Arbeit mit DNS 18
2.2.2.i.Isolierung von DNS Fragmenten aus Agarosegelen 18
2.2.2.2 Reinigung von DNS Fragmenten über Qia Säulchen 19
2.2.2.3 Enzymatische Spaltung von DNS Fragmenten mit
Restriktionsendonukleasen 19
2.2.2.4 Präparative Spaltung von DNS für Klonierungen 19
2.2.2.5 Dephosphorylierung von DNS Fragmenten 19
2.2.2.6 T4 DNS Polymerasebehandlung von PCR Produkten. 20
2.2.2.7 Phosphorylierung von DNS Fragmenten 20
2.2.2.8 Umklonierung des Polylinkers eines Transfektionsvectors 20
2.2.2.9 Blunt-End-Ügation 21
2.2.2.10 Transformation von DNS in kompetente Bakterien 21
2.2.2.H Identifizierung und Charakterisierung von rekomb. Bakterienklonen 22
2.2.2.12 Isolierung von DNS durch alkalische Schnelllyse 22
2.2.2.13 Isolierung von DNA mit dem Qia Maxi Kit 23
2.2.2.14 Isolierung von gesamtgenomischer zellulärer DNS 24
2.2.2.15 Agarose - Gelelektrophorese 24
2.2.2.16 Polymerase - Kettenreaktion 24
2.2.2.16.1 Herstellung von Primerpaaren für die PCR 25
2.2.2.16.2 PCR Ansatz 26
2.2.2.16.3 Verwendete PCR Programme 26
2.2.2.17 Southernblot 26
2.2.2.17.1 Herstellung von Sonden für den Southernblot 26
2.2.2.17.2 Durchführen des Blots 27
2.2.2.18 Colonylift 28
2.2.2.19 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNS 28
2.2.2.20 DNS Sequenzierung 29
2.2.3 Zellkulturtechniken 30
2.2.3.1 Herstellung von Medien 30
2.2.3.1.1 MEM10 und MEM2,5 30
2.2.3.1.2 Einfriermedium 30
2.2.3.1.3 Plaquemedium 30
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2.2.3.1.5 Inaktivierung von FCS 30
2.2.3.2 Auftauen von Zellen 31
2.2.3.3 Kultivierung von Zellen als Monolayerkulturen 31
2.2.3.4 Lagerung von Zellen 31
2.2.3.5 Bestimmung der Zellzahl 31
2.2.4 Arbeit mit Vacciniaviren 32
2.2.4.1 Auftauen von Vacciniaviren 32
2.2.4.2 Lagerung von Vacciniaviren 32
2.2.4.3 Infektion von Zellen mit Vacciniaviren 32
2.2.4.4 Produktion eines Vacciniavirus Wildtyp Stock 32
2.2.4.5 Infektion von Zellen für die Transfektion 33
2.2.4.6 Produktion von Vacciniavirus 33
2.2.4.7 Titerbestimmung eines VTT Stockes 33
2.2.?; Herstellung rekombinanter Vacciniaviren 34
2.2.5.1 Transfektion 34
2.2.5.2 Selektion und Screening rekombinanter Virusplaques 36
2.2.5.3 Reinigung 38
2.2.5.4 Amplifikation 38
2.2.5.5 Viruskontrolle 39
2.2.5.6 Produktion von Vacciniavirus 4°
2.2.6 Produktion von HBs-Antigen in der Zellkultur durch rekombinante
Vacciniaviren 4°
2.2.6.1 Produktion 40
2.2.6.2 Aufreinigung durch Ultrafiltration 4*
2.2.6.3 Aufreinigung durch präparative Gelfiltration 41
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2.2.7 Isolierung von Anti HBs aus human Seren 42
2.2.7.1 Isolierung von Anti HBs mit MAP-Trap™ 42
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2.2.7.3 Lagerung von Anti HBs 44
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2.2.8.1 Historische Entwicklung und allgemeines Funktionsprinzip 44
2.2.8.2 Auswahl der Messmethode 45
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2.2.8.4 Beschichtung der Quarze 48
2.2.8.5 Standardisierung der Messbedingungen 49
2.2.8.6 Abblocken unspezifischer Bindungen 50
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2.2.8.8 Auswertung der Frequenzkurven 52
2.2.8.9 Entstehung einer Frequenzbindungskurve 52
3. Ergebnisse 57
3.1 Produktion von HBs Antigen mit Hilfe rekombinanter Vacciniaviren 57
3.1.1 Herstellung der HBs-Antigen-Mutanten R145, Q141 und M125 mit Hilfe
rekombinanter Vacciniaviren. 58
3.1.2 Produktion von HBs-Antigen mit Hilfe von rekombinanten Vacciniaviren 59
3.2 Etablierung eines Messverfahrens am AFFCo 2000 zur Vermessung
von HBs-Antigen mit poly- und monoklonalen Anti-HBs. 61
3.2.1 Demonstration spezifischer Anti-HBs — HBs-Antigen -Interaktionen mit
dem AFFCo 2000 62
3.2.2 Vergleich verschiedener Testverfahren 63
3.2.3 Analyse von Einflussfaktoren und Standardisierung der
Messbedingungen. 66
3.2.3.1 Einfluss gerätespezifischer Faktoren 66
3.2.3.2 Absättigung unspezifischer Bindungsstellen 70
3.2.3.3 Einfluss der Dispersion auf das Bindungssignal 72
3.2.3.3.1 Reduktion des Einflusses der Viskosität auf die
Frequenzkurven des Biosensors 74
3.2.3.3.2 Relation von Viskositäts- und Bindungssignal 77
3.2.3.3.3 Reduktion des Einflusses der Dispersion durch die
Wahl der Auswerteareale 79
3.2.3.3.4 Streckenlänge der Auswertung 81
3.2.4 Messgenauigkeit und Reproduzierbarkeit der Antigenbeschichtung 85
3.2.4.1 Konzentrationsabhängigkeit des Frequenzabfalles 85
3.2.4.2 Bestimmung der Anzahl an gebundenen Antikörpern 85
3.2.4.3 Bestimmung der KD durch Mehrfachmessungen 86
3.2.e; Zusammenfassung der Ergebnisse zur Etablierung des
Messverfahrens am Biosensor 89
3.3 Messung von Anti-HBs - HBs-AntJgen Affinitäten mit dem
AFFCo 2000 8a
3.3.1 Das Bindungsverhalten von poly- und monoklonalen Antikörpern
gegenüber HBs-Antigen von GSK 90
3.3.2 Das Bindungsverhalten von poly- und monoklonalen Antikörperisolaten
gegenüber verschiedenen Antigenen 95
3.4 Zusammenfassung: 110
4. Diskussion 111
4.1 Weltweite Bedeutung von HBV und zentrale Rolle der
HBs-Antigen — Anti-HBs-Interaktion 111
4.2 Der AFFCo 2000 ist ein anerkanntes Messverfahren für die
Charakterisierung von Anlägen — Antikörper — Affinitäten 112
4.2.1 Herstellung einer spezifischen Beschichtung der Messquarze 113
4.2.2 Effektive Äbsättigung unspezifischer Bindungsstellen durch
HBs-Antigen- und Anti-HBs-freies Humanserum. 114
4.2.3 Die spezifische Messung von Anti-HBs - HBs-Antigen - Affinitäten 115
4.3 Auswahl der Antigenbeschichtung 115
4.4 Reproduzierbarkeit und Reliabilität der Messungen H7
4.4.1 Standardisierbarkeit der Messbedingungen 117
4.4.2 Etablierung einer verlässlichen Auswertung 118
4.4.3 Reproduzierbarkeit 120
4.4.4 Vermessung monoklonaler Antikörper 125
4.5 Vermessung von Anti-HBs - HBs Antigen Affinitäten geimpfter
Erwachsener J^Z
4.5.1 Besonderheiten bei der Vermessung polyklonaler Antikörper 127
4.5.2 Vermessung polyklonaler Antikörper mit dem HBs-Antigen 128
4» 6 Vermessung von HBs-Antigen Mutanten mit poly- und monoklonalen
Anti-HBs 12Q
4.6.1 Auswahl des Produktionsverfahrens 130
4.6.2 Auswahl der Mutanten 130
4.6.3 Vermessung der HBs Antigen Mutanten 133
4.7 Zusammenfassung 135
x. Literaturverzeichnis 136
6. Abkürzungsverzeichnis 14.Q
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