Effekt von Darbepoetin alfa auf die geschädigte Niere am ApoE(-/-)-Mausmodell:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis i
Inhaltsverzeichnis
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
1.1 Summary 2
2 EINLEITUNG: HINTERGRUND UND STAND DER FORSCHUNG 4
2.1 Chronische Niereninsuffizienz 4
2.1.1 Epidemiologie und Mortalität 4
2.1.2 Progressionsfaktoren 6
2.1.3 Das ApoE (-/-) Maus Modell 7
2.1.4 Das ApoE (-/-) Maus Modell mit chronischer Niereninsuffizienz 8
2.1.5 Pathogenese der Atherosklerose 9
2.2 Erythropoesis stimulating Agents (ESAs) 12
2.2.1 Von der Entdeckung zur gentechnologischen Produktion 12
2.2.2 Charakteristika der Erythropoese stimulierenden Faktoren 14
2.2.3 Biosynthese und Regulation von endogenem EPO 16
2.2.4 Hämatopoetische Funktion der ESAs 18
2.2.5 Nicht-hämatopoetische Wirkung der ESAs 20
2.2.6 Der hämatopoetische und protektive Mechanismus der ESAs 22
2.2.7 Therapie der Anämie mit Darbepoetin bei Niereninsuffizienz 26
2.3 Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit 30
3 MATERIAL UND METHODEN 31
3.1 Versuchsdesign 31
3.2 Versuchsdesign der IVlicroarray-Genexpressionsanalyse 31
3.3 Versuchstiere 32
3.3.1 Haltung und Fütterung 32
3.3.2 Uni- und subtotale Nephrektomie 32
3.3.3 Darbepoetingabe 33
3.4 Bestimmung klinischer Parameter 33
3.4.1 Hämatokritmessung 33
3.4.2 Serumanalytik 34
3.4.3 Urinanalytik 34
Inhaltsverzeichnis ii
3.5 Fixation und Präparation 34
3.5.1 Intraarterielle Blutdruckmessung und Perfusionsfixation 34
3.5.2 Histologische Gewebeaufarbeitung 35
3.6 Histochemische Färbemethode 36
3.6.1 HE-Übersichtsfärbung 36
3.6.2 PAS Färbung 37
3.6.3 Sirius-Red Färbung 38
3.7 Morphologie 39
3.7.1 Glomeruloskleroseindex 39
3.7.2 Mesangiolyseindex 40
3.7.3 Tubulärer Schädigungsindex 41
3.7.4 Glomerulusvolumen 42
3.7.5 Morphologie der renalen Arteria arcuata 42
3.8 Immunhistochemie 44
3.8.1 Methodentheorie der Immunhistochemie 44
3.8.2 Protokolle zur Durchführung der ABC Methode 46
3.8.3 Sonderprotkoll der„Mouse on Mouse Methode 47
3.8.4 Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Präparate 48
3.8.5 Doppelfärbungen mit Fluoreszenzmikroskopie 50
3.8.6 Protokoll der Doppelfärbung 51
3.9 Immunoblot 52
3.9.1 Methodentheorie des Western-Blots 52
3.9.2 Protokoll zur Durchführung des Western Blots 53
3.10 Molekularbiologische Untersuchung 55
3.10.1 Isolierung von Gesamt-RNA 55
3.10.2 cDNA Gewinnung 56
3.10.3 Real-timePCR 57
3.10.4 Oligonukleotid-Microarray Analyse 66
3.11 Statistik 70
4 ERGEBNISSE 71
4.1 Affymetrix-Microarray Analyse 71
4.1.1 Microarray Qualitätsbericht 71
4.1.2 Filterkriterien der Expressionsanalyse 72
4.1.3 Analyse der Genexpressionänderung durch UNX und SNX 73
4.1.4 Überprüfung der Regulation durch real-time PCR 80
Inhaltsverzeichnis iii
4.2 Effekte von NESP auf die geschädigte Niere 82
4.2.1 Tierdaten 82
4.2.2 Ergebnisse der morphologischen Untersuchung der Niere 87
4.2.3 Oxidativer Stress 92
4.2.4 Entzündung 97
4.2.5 Proliferation 103
4.2.6 Apoptose 104
5 DISKUSSION 106
5.1 Auswirkung von UNX und SNX im ApoE(-/-) Modell 106
5.2 Effekt von NESP auf die vaskuläre Funktion und Struktur der Niere 109
5.3 Anti-oxidative Effekte von NESP 111
5.4 Anti-entzündliche Effekte von NESP 112
5.5 Pro-proliferative Effekte von NESP 114
5.6 Anti-apoptotische Effekte von NESP 114
5.7 Limitierende Aspekte der Untersuchung 115
5.8 Schlussfolgerung und Ausblick 115
6 ANHANG 117
6.1 Materialien Immunhistochemie 117
6.2 Materialien Western Blot 123
6.3 Übersicht über die verwendete Software 124
7 LITERATURVERZEICHNIS 126
8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 144
9 DANKSAGUNG 146
10 LEBENSLAUF 148
|
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Inhaltsverzeichnis i
Inhaltsverzeichnis
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
1.1 Summary 2
2 EINLEITUNG: HINTERGRUND UND STAND DER FORSCHUNG 4
2.1 Chronische Niereninsuffizienz 4
2.1.1 Epidemiologie und Mortalität 4
2.1.2 Progressionsfaktoren 6
2.1.3 Das ApoE (-/-) Maus Modell 7
2.1.4 Das ApoE (-/-) Maus Modell mit chronischer Niereninsuffizienz 8
2.1.5 Pathogenese der Atherosklerose 9
2.2 Erythropoesis stimulating Agents (ESAs) 12
2.2.1 Von der Entdeckung zur gentechnologischen Produktion 12
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2.2.7 Therapie der Anämie mit Darbepoetin bei Niereninsuffizienz 26
2.3 Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit 30
3 MATERIAL UND METHODEN 31
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3.4 Bestimmung klinischer Parameter 33
3.4.1 Hämatokritmessung 33
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Inhaltsverzeichnis ii
3.5 Fixation und Präparation 34
3.5.1 Intraarterielle Blutdruckmessung und Perfusionsfixation 34
3.5.2 Histologische Gewebeaufarbeitung 35
3.6 Histochemische Färbemethode 36
3.6.1 HE-Übersichtsfärbung 36
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3.7.5 Morphologie der renalen Arteria arcuata 42
3.8 Immunhistochemie 44
3.8.1 Methodentheorie der Immunhistochemie 44
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3.8.6 Protokoll der Doppelfärbung 51
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4.1.2 Filterkriterien der Expressionsanalyse 72
4.1.3 Analyse der Genexpressionänderung durch UNX und SNX 73
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Inhaltsverzeichnis iii
4.2 Effekte von NESP auf die geschädigte Niere 82
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5.1 Auswirkung von UNX und SNX im ApoE(-/-) Modell 106
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5.7 Limitierende Aspekte der Untersuchung 115
5.8 Schlussfolgerung und Ausblick 115
6 ANHANG 117
6.1 Materialien Immunhistochemie 117
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