Induzierbare Genexpression in humanen mesenchymalen Stammzellen:
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2008
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis —
A Zusammenfassung 1
B Einleitung 2
B1 Stammzellen 3
B1.1 Definition 3
B1.2 Stammzelldifferenzierung 4
B1.3 Adulte Stammzellen 5
B1.4 Embryonale Stammzellen 6
B1.5 Therapeutische Ansätze 7
B2 Transfektion von humanen mesenchymalen Stammzellen 8
B2.1 Liposomaler Gentransfer 8
B2.2 Transiente Transfektion 8
B2.3 Kotransfektion 9
B2.4 Stabile Transfektion 9
B2.5 Transfektion von Reporterplasmiden in hMSC 10
B3 Induzierbare Genexpression 11
B3.1 Tetracyelin-abhängige Genregulation 11
B3.2 Weiterentwicklung der induzierbaren Genexpression 13
B4 Der Transkriptionsfaktor P0U5F1 15
B4.1 Eukaryotische Genregulation 15
B4.2 Genomisehe Struktur des Transkriptionsfaktors P0U5F1 15
B4.3 Proteinstruktur und Bindungseigenschaften des Transkriptionsfaktors P0U5F1 16
B4.4 P0U5F1 als zentraler Regulator der Pluripotenz? 18
B5 Aufgabenstellung 19
Inhaltsverzeichnis |l
C Material und Methoden 20
C1 Materialien 20
C1.1 Geräte 20
C1.2 Materialien und Substanzen 21
C1.2.1 Allgemeine Materialien 21
C1.2.2 Substanzen für die Zellkultur 22
C1.2.3 Zelllinien 22
C1.2.4 Chemikalien für die Molekularbiologie 23
C1.2.5 Bakterienstämme und Nährmedien 24
C1.2.6 Oligonukleotide 25
C1.2.7 Plasmide 25
C2 Methoden 31
C2.1 Molekularbiologie 31
C2.1.1 Anzucht und Stammhaltung von Escherichia coli 31
C2.1.2 Herstellung und Transformation kompetenter Zellen 31
C2.1.3 Elektroporation 32
C2.1.4 Isolierung von Plasmid-DNA 33
C2.1.5 Reinigung, Konzentrierung und Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 34
C2.1.6 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen 35
C2.1.7 Agarose-Gel-Elektrophorese zur Trennung von DNA-Fragmenten 36
C2.1.8 Isolierung von DNA aus Agarose-Gelen 36
C2.1.9 Ligierung von DNA-Fragmenten 36
C2.1.10 Auffüllreaktion mit DNA-Polymerase I (Klenow) 37
C2.1.11 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten 37
C2.1.12 PCR-Amplifikation von DNA 38
C2.1.13Topo-TA-Klonierung 38
C2.1.14 DNA-Sequenzierung 39
C2.1.15RNA-Isolation 39
C2.1.16 cDNA-Synthese für die quantitative RT-PCR 39
C2.1.17 Quantitative RT-PCR 40
C2.2 Zellbiologie 41
C2.2.1 Kultivierung und Konservierung von hMSC 41
C2.2.2 Transfektion 43
C2.2.3 Toxizitätsanalysen von Geneticin und Doxycyclin 45
C2.2.4 Proliferationsstudien mit CyQuant® 46
C2.2.5 Luziferase-Aktivitätsbestimmung 46
C2.2.6 CHO-Zellen als Kontrolle für das Tet-On-System 47
C2.3 Statistische Analyse 47
Inhaltsverzeichnis | II
D Ergebnisse 48
D1 Toxizitätsanalysen 48
D1.1 Doxycyclin 48
D1.2 Dosis-Wirkungskurven von Geneticin bei hMSC 48
D2 Generierung und Transfektion von Plasmiden mit Reportergenen 49
D2.1 Generierung von Plasmiden mit Reportergenen 49
D2.1.1 pEGFPLuc-IRESneo2 49
D2.1.2 pLucEGFP 50
D2.2 Transiente Transfektion von Plasmiden mit Reportergenen 51
D2.2.1 Optimierung über EGFP-Fluoreszenz 51
D2.2.2 Verifizierung über Luziferase-Aktivität 52
D3 Induzierbare Genexpression mittels des Tet-On-Systems 53
D3.1 Validierung an CHO-Zellen 53
D3.2 FBS-Untersuchung 54
D3.3 Plasmid-Generierung zur regulierbaren Genexpression 54
D3.3.1 pTRE2hyg-EGFP 55
D3.3.2 pTRE2hyg-P0U5F1_iA bzw.-P0U5F1JB 55
D3.4 Transiente Transfektionen 56
D3.4.1 Optimierung der Transfektion von pTet-On 56
D3.4.2 Kotransfektion von pTet-On und pTRE2hyg-Luc 58
D3.4.3 Kotransfektion von pTet-On und pTRE2hyg-EGFP 59
D3.5 Stabile Transfektion von pTet-On 60
D3.5.1 Transfektion und Selektion von pTet-On stabil transfizierten hMSC 61
D3.5.2 Klonale Expansion und selektive Trypsinierung 61
D3.5.3 Test auf Expression bzw. Funktionalität des Transaktivators rtTA 62
D3.5.4 Kryokonservierung und Subkultivierung von pTet-On stabilen hMSC 63
InhaltsverzeichnisI III
D4 Induzierbare Genexpression mit p2in1 64
D4.1 Generierung des Vektors p2in1 64
D4.1.1 Generierung von pTet-0n-PmntiCMV 66
D4.1.2 Generierung von pCR2.1-TOPb-PmirihCMV-rtTA-polyA 66
D4.1.3 Generierung von pTRE2hyg-AX/)ol 5392 67
D4.1.4 Generierung von p2in1 68
D4.1.5 Generierung von p2in1-Luc 69
D4.2 Transiente Transfektion von p2in 1 -Luc 70
D5 Expression des Trankriptionsfaktors P0U5F1_iA 72
D5.1 Generierung von Plasmiden 72
D5.1.1 Generierung von p-P0U5F1_iA bzw. P0U5Fi_iB-IRES-neo2 72
D5.1.2 Generierung von pcDNA3.1-POU5F1_iA bzw. P0U5F1JB 72
D5.1.3 Generierung von p-P0U5Fi_iA- bzw. P0U5F1JB-IRES-EGFP 73
D5.2 Transiente Transfektion 74
D5.2.1 Optimierung der Transfektion 74
D5.2.2 Expressionskontrolle über quantitative RT-PCR 74
D5.2.3 Proliferationsverhalten von P0U5Fi_iA-transfizierten hMSC 76
InhaltsverzeichnisI IV
E Diskussion 77
El Transfektion in hMSC 77
El .1 Liposomaler Gentransfer 77
EL2Transiente Transfektion 79
E1.3 Stabile Transfektion 82
E1.4 Einsatz bicistronischer Vektoren 84
E2 Induzierbare Genexpression 85
E2.1 Angewandte Methoden zur Geninduktion in hMSC 85
E2.1.1 Induzierbare Genexpression in hMSC mittels transienter Kotransfektion 85
E2.1.2 Induzierbare Genexpression in pTet-On stabil transfizierten hMSC 85
E2.1.3 Induzierbare Genexpression in hMSC mit p2in1 86
E2.2 Vergleich der angewandten Methoden für induzierbare Genexpression 88
E2.2.1 Unspezifische Aktivität 88
E2.2.2 Maximale Induktion 90
E2.2.3 Tetracyclin als Induktor der Genexpression 91
E2.2.4 Dosisabhängige Luziferase-Expression 92
E2.2.5 Effekte des Transaktivators 93
E2.2.6 Verhältnis des Transaktivators zu TRE 93
E2.2.7 Folgerungen 94
E3 Expression des Trankriptionsfaktors P0U5Fi_iA in hMSC 95
E3.1 Basale Expression des Transkriptionsfaktors P0U5F1 in hMSC 96
E3.2 Auswirkungen der Transfektion des Transkriptionsfaktors P0U5F1 in hMSC 97
E3.3 Die Interaktion von P0U5F1 mit anderen Faktoren 97
F Ausblick 98
G Literaturverzeichnis 99
Danksagung 115
Lebenslauf 116
Inhaltsverzeichnis |V
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis —
A Zusammenfassung 1
B Einleitung 2
B1 Stammzellen 3
B1.1 Definition 3
B1.2 Stammzelldifferenzierung 4
B1.3 Adulte Stammzellen 5
B1.4 Embryonale Stammzellen 6
B1.5 Therapeutische Ansätze 7
B2 Transfektion von humanen mesenchymalen Stammzellen 8
B2.1 Liposomaler Gentransfer 8
B2.2 Transiente Transfektion 8
B2.3 Kotransfektion 9
B2.4 Stabile Transfektion 9
B2.5 Transfektion von Reporterplasmiden in hMSC 10
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B3.2 Weiterentwicklung der induzierbaren Genexpression 13
B4 Der Transkriptionsfaktor P0U5F1 15
B4.1 Eukaryotische Genregulation 15
B4.2 Genomisehe Struktur des Transkriptionsfaktors P0U5F1 15
B4.3 Proteinstruktur und Bindungseigenschaften des Transkriptionsfaktors P0U5F1 16
B4.4 P0U5F1 als zentraler Regulator der Pluripotenz? 18
B5 Aufgabenstellung 19
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C Material und Methoden 20
C1 Materialien 20
C1.1 Geräte 20
C1.2 Materialien und Substanzen 21
C1.2.1 Allgemeine Materialien 21
C1.2.2 Substanzen für die Zellkultur 22
C1.2.3 Zelllinien 22
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C1.2.5 Bakterienstämme und Nährmedien 24
C1.2.6 Oligonukleotide 25
C1.2.7 Plasmide 25
C2 Methoden 31
C2.1 Molekularbiologie 31
C2.1.1 Anzucht und Stammhaltung von Escherichia coli 31
C2.1.2 Herstellung und Transformation kompetenter Zellen 31
C2.1.3 Elektroporation 32
C2.1.4 Isolierung von Plasmid-DNA 33
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C2.1.6 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen 35
C2.1.7 Agarose-Gel-Elektrophorese zur Trennung von DNA-Fragmenten 36
C2.1.8 Isolierung von DNA aus Agarose-Gelen 36
C2.1.9 Ligierung von DNA-Fragmenten 36
C2.1.10 Auffüllreaktion mit DNA-Polymerase I (Klenow) 37
C2.1.11 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten 37
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C2.1.16 cDNA-Synthese für die quantitative RT-PCR 39
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C2.2.4 Proliferationsstudien mit CyQuant® 46
C2.2.5 Luziferase-Aktivitätsbestimmung 46
C2.2.6 CHO-Zellen als Kontrolle für das Tet-On-System 47
C2.3 Statistische Analyse 47
Inhaltsverzeichnis | II
D Ergebnisse 48
D1 Toxizitätsanalysen 48
D1.1 Doxycyclin 48
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D2 Generierung und Transfektion von Plasmiden mit Reportergenen 49
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E Diskussion 77
El Transfektion in hMSC 77
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E2.1 Angewandte Methoden zur Geninduktion in hMSC 85
E2.1.1 Induzierbare Genexpression in hMSC mittels transienter Kotransfektion 85
E2.1.2 Induzierbare Genexpression in pTet-On stabil transfizierten hMSC 85
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