Der Experimentator: Immunologie:
Gespeichert in:
| Format: | Buch |
|---|---|
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Heidelberg
Spektrum, Akad. Verl.
2009
|
| Ausgabe: | 3. Aufl. |
| Schriftenreihe: | Der Experimentator
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltstext Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Literaturangaben |
| Beschreibung: | XIV, 309 S. Ill., graph. Darst. 25 cm |
| ISBN: | 9783827420268 3827420261 |
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Inhaltsverzeichnis
Vorwort zur 3. Auflage.
V
Vorwort.
VI
Exkurse. XII
Abkürzungen. XIII
1 Antikörper. 1
1.1 Des Antikörpers Eigenheiten. 2
1.1.1 Molekülstruktur von Antikörpern. 2
1.1.2 Die Antigen-Antikörper-Bindung. 7
1.2 Herstellung von Antikörpern. 7
1.2.1 Das
Antigen
. 8
1.2.2 Die Wahl der Spezies. 11
1.2.3
Antigenapplikation
. 12
1.2.4 Polyklonale Antikörper. 15
1.2.5 Monoklonale Antikörper. 19
1.2.6 Rekombinante Antikörper. 22
1.3 Reinigung von Antikörpern. 25
1.3.1 „Quick
and dirty"
- Präzipitationsmethoden. 27
1.3.2 Affinitätschromatographie. 28
1.3.3 Klassische Methoden der Proteinreinigung. 30
1.3.4 Aufreinigung von IgY aus Eigelb. 33
1.3.5 Aufreinigung rekombinanter Antikörper. 34
1.3.6 Wichtige analytische Techniken. 35
1.4 Chemische Kopplung und Markierung von Antikörpern. 38
1.4.1 Chemische Kopplung von Antikörpern an feste Phasen. 39
1.4.2 Kopplung von Markerenzymen an Antikörper. 41
1.4.3 Kopplung von Fluorochromen an Antikörper. 43
1.4.4 Kopplung von Biotin. 47
1.4.5 Markierung mit Gold. 49
1.4.6 Markierung mit radioaktiven Isotopen. 50
2 Zellseparation. 53
2.1 Trennung nach Zellgröße und Zelldichte - Zentrifugationstechniken. 53
2.1.1 Differenzialzentrifugation. 54
2.1.2 Dichtegradienten-Zentrifugation. 55
2.1.3 Separationsmedien. 56
2.1.4 Gegenstromzentrifugation. 66
2.2 Trennung nach zellspezifischen Oberflächenmolekülen. 68
2.2.1 Adhäsion an KunststofFoberflächen. 68
2.2.2 Adhäsion an Nylonwatte. 70
2.2.3 Erythrocyten-Rosettienmg. 71
VIII
· Inhaltsverzeichnis
2.2.4 Immunmagnetische Separation. 73
2.2.5 Lysierende Antikörper. 75
3 Durchflusscytometrie. 77
3.1 Wie funktioniert das eigentlich?. 78
3.2 Fluoreszenzen. 81
3.3 Probenvorbereitung. 85
3.3.1 Zellmarkierung. 85
3.4 Inbetriebnahme des Durchflusscytometers. 90
3.5 Kompensation und Messung. 92
3.5.1 Kompensation. 92
3.5.2 Messung. 97
3.6 Auswertung. 101
3.6.1 Histogramm-Plot. 101
3.6.2
Dot-Plot
. 101
3.6.3
Dichtepiot.
102
3.6.4 Konturplot. 103
3.6.5 Isometrische Darstellung. 103
3.7 Modelle und Ausstattungen. 103
3.7.1 Autosampier. 103
3.7.2 Zellsorter. 104
4 Quantitative Immunoassays. 107
4.1 Assaykonzepte. 108
4.1.1 Der kompetitive
Assay
. 109
4.1.2 Der Sandwich-
Assay
. 110
4.1.3 Welches Assaykonzept für welche Anwendung?. 111
4.2 Radioimmunoassay (RIA). 112
4.2.1 Historisches. 112
4.2.2 Praktisches. 113
4.3
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
(ELISA).
115
4.3.1
Coaten,
Blocken, Waschen. 116
4.3.2 Enzyme und Substrate. 118
4.3.3
ELISA in
der Praxis. 119
4.4 ELISPOT-Assay. 122
4.4.1 Anwendung und Vergleich mit anderen Methoden. 122
4.4.2 Prinzip und Praxis. 124
4.5 Partikel-Immunoassay (PIA). 127
4.5.1 Prinzip der Mini-Kugeln. 127
4.5.2
Trapping-Assay
. 127
4.5.3
Multiplex-Assay.
129
4.5.4 Vergleich mit anderen Immunoassays. 129
4.6 Verstärkersysteme. 131
4.6.1 Erhöhung der Markerdichte. 132
Inhaltsverzeichnis ■
IX
4.6.2 Multi-Enzym-Kaskaden. 134
4.6.3 Immuno-PCR. 134
5 Western-BIot. 139
5.1 Probenvorbereitung. 139
5.2 Auftrennung eines Proteingemisches mittels Gelelektrophorese. 141
5.2.1 Die diskontinuierliche SDS-PAGE. 141
5.2.2
Native
Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierang. 145
5.3 Transfer der Proteine auf eine Membran
(Blot)
. 147
5.3.1
Wet-Blot.
148
5.3.2
Semi-Dry-Blot
. 149
5.3.3 Fehlerquellen. 149
5.4 Proteindetektion. 151
5.4.1
Blocking.
151
5.4.2 Antikörpermarkierung. 152
5.4.3 Visualisierung. 154
5.4.4
„Stripping"
und „Re-probing" von Westera-Blot-Membranen. 155
5.4.5 Fehlerquellen und Kontrollen. 155
5.5
Dot-
und Slot-Blot. 156
6 in sv/H-lnimunlokalisatioii. 159
6.1 Untersuchung von Zellsuspensionen. 159
.1 Zellsuspensionen. 160
.2 Cytospins. 160
.3 Zellausstriche. 160
.4 Einbettung von Zellen. 161
.5 Variationen und Details zur Behandlung von Zellsuspensionen. 161
6.2 Untersuchung von Geweben. 163
6.2.1 Vorbereitung. 163
6.2.2 Fixierung. 163
6.2.3 Paraffin-Einbettung. 168
6.2.4 Schneiden. 169
6.2.5 Nachbehandlung. 170
6.2.6 Immundetektion. 171
6.2.7 Eindeckung. 184
6.3 Immunelektronenmikroskopische Untersuchung von Geweben. 186
6.3.1 Fixierung. 186
6.3.2 Einbettung. 186
6.3.3
Mikrotomie
. 188
6.3.4 Immundetektion. 188
7 Immunpräzipitation. 191
7.1 Die Klassiker. 193
7.1.1 Eindimensionale Immundiffusion. 193
7.1.2 Zweidimensionale Immundiffusion nach Ouchterlony. 195
7.1.3 Radiale Immundiffusion nach
Mancini
. 196
Χ
■ Inhaltsverzeichnis
7.1.4 Immunelektrophoresen. 198
7.1.5 Limitierung und aktuelle Bedeutung. 202
7.2 Immunpräzipitation „heute". 202
7.2.1 Die Präzipitationsmatrix. 203
7.2.2 Reduktion unspezifisch präzipitierender Proteine. 204
7.2.3 Analyse der Immunpräzipitate. 205
8 Die Zelle: leben, fressen, sterben. 207
8.1 Zellviabilitätsbestimmung. 207
8.1.1 Farbstoff-Exklusion. 207
8.1.2 Tetrazoliumsalz-Reduktion. 208
8.1.3 ATP-Assay. 210
8.2 Zellproliferation. 211
8.2.1 DNA-Markierung mit [3H]Thymidin. 212
8.2.2 DNA-Markierung mit S-Brom^'-desoxyuridin (BrdU). 212
8.2.3 Durchflusscytometrische Bestimmung der Zellproliferation. 213
8.3 Phagocytose-Assays. 215
8.3.1 Die Testpartikel - Futter für die Phagocyten. 216
8.3.2 Methoden der Partikelvisualisierung. 217
8.4 Zellvermittelte Cytotoxizität. 221
8.4.1 Chromp'CrI-release-Assay. 222
8.4.2 Lactat-DehydrogenasetbDHyrelease-Assay. 222
8.4.3 DurchflusscytometrischerCytotoxizitätsnachweis. 225
8.5 Apoptose-Assays. 226
8.5.1 Färbungen des Zellkerns. 229
8.5.2 DNA-Leiter. 229
8.5.3 Nucleosomen-Quantifizierungs-ELISA. 230
8.5.4 TUNEL-Technik. 232
8.5.5 Annexin
V
. 232
8.5.6 Messung von Caspase-Aktivität. 233
8.5.7 Sonstiges. 235
9 Spezielle Immuno-Assays. 237
9.1 Blutgruppenbestimmung. 237
9.2 HLA-Typisierung. 241
9.2.1 Lymphocytotoxizitätstest. 242
9.3 Lymphoblastentransformation. 244
10 Ein kurzer Ausflug in die ungeliebte Welt der Statistik. 247
10.1 Deskriptive Statistik. 249
10.1.1 Lokationsmaße. 250
10.1.2 Streuungsmaße. 251
10.1.3 Korrelationsmaße. 255
10.2 Prüfstatistik. 256
10.2.1 Skalen und ihre Daten. 256
10.2.2 Skizze des Ablaufs einer wissenschaftlichen Untersuchung. 257
10.2.3 Die Wahl eines geeigneten Signifikanztests. 260
Inhaltsverzeichnis ■
XI
11 Naturwissenschaft
vs.
Übernatürliches. 267
Anhang 1: CD-Antigene. 268
Anhang 2: Cytokine. 287
Anhang 3: Chemokine. 291
Glossar . 294
Register . 304 |
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Inhaltsverzeichnis
Vorwort zur 3. Auflage.
V
Vorwort.
VI
Exkurse. XII
Abkürzungen. XIII
1 Antikörper. 1
1.1 Des Antikörpers Eigenheiten. 2
1.1.1 Molekülstruktur von Antikörpern. 2
1.1.2 Die Antigen-Antikörper-Bindung. 7
1.2 Herstellung von Antikörpern. 7
1.2.1 Das
Antigen
. 8
1.2.2 Die Wahl der Spezies. 11
1.2.3
Antigenapplikation
. 12
1.2.4 Polyklonale Antikörper. 15
1.2.5 Monoklonale Antikörper. 19
1.2.6 Rekombinante Antikörper. 22
1.3 Reinigung von Antikörpern. 25
1.3.1 „Quick
and dirty"
- Präzipitationsmethoden. 27
1.3.2 Affinitätschromatographie. 28
1.3.3 Klassische Methoden der Proteinreinigung. 30
1.3.4 Aufreinigung von IgY aus Eigelb. 33
1.3.5 Aufreinigung rekombinanter Antikörper. 34
1.3.6 Wichtige analytische Techniken. 35
1.4 Chemische Kopplung und Markierung von Antikörpern. 38
1.4.1 Chemische Kopplung von Antikörpern an feste Phasen. 39
1.4.2 Kopplung von Markerenzymen an Antikörper. 41
1.4.3 Kopplung von Fluorochromen an Antikörper. 43
1.4.4 Kopplung von Biotin. 47
1.4.5 Markierung mit Gold. 49
1.4.6 Markierung mit radioaktiven Isotopen. 50
2 Zellseparation. 53
2.1 Trennung nach Zellgröße und Zelldichte - Zentrifugationstechniken. 53
2.1.1 Differenzialzentrifugation. 54
2.1.2 Dichtegradienten-Zentrifugation. 55
2.1.3 Separationsmedien. 56
2.1.4 Gegenstromzentrifugation. 66
2.2 Trennung nach zellspezifischen Oberflächenmolekülen. 68
2.2.1 Adhäsion an KunststofFoberflächen. 68
2.2.2 Adhäsion an Nylonwatte. 70
2.2.3 Erythrocyten-Rosettienmg. 71
VIII
· Inhaltsverzeichnis
2.2.4 Immunmagnetische Separation. 73
2.2.5 Lysierende Antikörper. 75
3 Durchflusscytometrie. 77
3.1 Wie funktioniert das eigentlich?. 78
3.2 Fluoreszenzen. 81
3.3 Probenvorbereitung. 85
3.3.1 Zellmarkierung. 85
3.4 Inbetriebnahme des Durchflusscytometers. 90
3.5 Kompensation und Messung. 92
3.5.1 Kompensation. 92
3.5.2 Messung. 97
3.6 Auswertung. 101
3.6.1 Histogramm-Plot. 101
3.6.2
Dot-Plot
. 101
3.6.3
Dichtepiot.
102
3.6.4 Konturplot. 103
3.6.5 Isometrische Darstellung. 103
3.7 Modelle und Ausstattungen. 103
3.7.1 Autosampier. 103
3.7.2 Zellsorter. 104
4 Quantitative Immunoassays. 107
4.1 Assaykonzepte. 108
4.1.1 Der kompetitive
Assay
. 109
4.1.2 Der Sandwich-
Assay
. 110
4.1.3 Welches Assaykonzept für welche Anwendung?. 111
4.2 Radioimmunoassay (RIA). 112
4.2.1 Historisches. 112
4.2.2 Praktisches. 113
4.3
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
(ELISA).
115
4.3.1
Coaten,
Blocken, Waschen. 116
4.3.2 Enzyme und Substrate. 118
4.3.3
ELISA in
der Praxis. 119
4.4 ELISPOT-Assay. 122
4.4.1 Anwendung und Vergleich mit anderen Methoden. 122
4.4.2 Prinzip und Praxis. 124
4.5 Partikel-Immunoassay (PIA). 127
4.5.1 Prinzip der Mini-Kugeln. 127
4.5.2
Trapping-Assay
. 127
4.5.3
Multiplex-Assay.
129
4.5.4 Vergleich mit anderen Immunoassays. 129
4.6 Verstärkersysteme. 131
4.6.1 Erhöhung der Markerdichte. 132
Inhaltsverzeichnis ■
IX
4.6.2 Multi-Enzym-Kaskaden. 134
4.6.3 Immuno-PCR. 134
5 Western-BIot. 139
5.1 Probenvorbereitung. 139
5.2 Auftrennung eines Proteingemisches mittels Gelelektrophorese. 141
5.2.1 Die diskontinuierliche SDS-PAGE. 141
5.2.2
Native
Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierang. 145
5.3 Transfer der Proteine auf eine Membran
(Blot)
. 147
5.3.1
Wet-Blot.
148
5.3.2
Semi-Dry-Blot
. 149
5.3.3 Fehlerquellen. 149
5.4 Proteindetektion. 151
5.4.1
Blocking.
151
5.4.2 Antikörpermarkierung. 152
5.4.3 Visualisierung. 154
5.4.4
„Stripping"
und „Re-probing" von Westera-Blot-Membranen. 155
5.4.5 Fehlerquellen und Kontrollen. 155
5.5
Dot-
und Slot-Blot. 156
6 in sv/H-lnimunlokalisatioii. 159
6.1 Untersuchung von Zellsuspensionen. 159
.1 Zellsuspensionen. 160
.2 Cytospins. 160
.3 Zellausstriche. 160
.4 Einbettung von Zellen. 161
.5 Variationen und Details zur Behandlung von Zellsuspensionen. 161
6.2 Untersuchung von Geweben. 163
6.2.1 Vorbereitung. 163
6.2.2 Fixierung. 163
6.2.3 Paraffin-Einbettung. 168
6.2.4 Schneiden. 169
6.2.5 Nachbehandlung. 170
6.2.6 Immundetektion. 171
6.2.7 Eindeckung. 184
6.3 Immunelektronenmikroskopische Untersuchung von Geweben. 186
6.3.1 Fixierung. 186
6.3.2 Einbettung. 186
6.3.3
Mikrotomie
. 188
6.3.4 Immundetektion. 188
7 Immunpräzipitation. 191
7.1 Die Klassiker. 193
7.1.1 Eindimensionale Immundiffusion. 193
7.1.2 Zweidimensionale Immundiffusion nach Ouchterlony. 195
7.1.3 Radiale Immundiffusion nach
Mancini
. 196
Χ
■ Inhaltsverzeichnis
7.1.4 Immunelektrophoresen. 198
7.1.5 Limitierung und aktuelle Bedeutung. 202
7.2 Immunpräzipitation „heute". 202
7.2.1 Die Präzipitationsmatrix. 203
7.2.2 Reduktion unspezifisch präzipitierender Proteine. 204
7.2.3 Analyse der Immunpräzipitate. 205
8 Die Zelle: leben, fressen, sterben. 207
8.1 Zellviabilitätsbestimmung. 207
8.1.1 Farbstoff-Exklusion. 207
8.1.2 Tetrazoliumsalz-Reduktion. 208
8.1.3 ATP-Assay. 210
8.2 Zellproliferation. 211
8.2.1 DNA-Markierung mit [3H]Thymidin. 212
8.2.2 DNA-Markierung mit S-Brom^'-desoxyuridin (BrdU). 212
8.2.3 Durchflusscytometrische Bestimmung der Zellproliferation. 213
8.3 Phagocytose-Assays. 215
8.3.1 Die Testpartikel - Futter für die Phagocyten. 216
8.3.2 Methoden der Partikelvisualisierung. 217
8.4 Zellvermittelte Cytotoxizität. 221
8.4.1 Chromp'CrI-release-Assay. 222
8.4.2 Lactat-DehydrogenasetbDHyrelease-Assay. 222
8.4.3 DurchflusscytometrischerCytotoxizitätsnachweis. 225
8.5 Apoptose-Assays. 226
8.5.1 Färbungen des Zellkerns. 229
8.5.2 DNA-Leiter. 229
8.5.3 Nucleosomen-Quantifizierungs-ELISA. 230
8.5.4 TUNEL-Technik. 232
8.5.5 Annexin
V
. 232
8.5.6 Messung von Caspase-Aktivität. 233
8.5.7 Sonstiges. 235
9 Spezielle Immuno-Assays. 237
9.1 Blutgruppenbestimmung. 237
9.2 HLA-Typisierung. 241
9.2.1 Lymphocytotoxizitätstest. 242
9.3 Lymphoblastentransformation. 244
10 Ein kurzer Ausflug in die ungeliebte Welt der Statistik. 247
10.1 Deskriptive Statistik. 249
10.1.1 Lokationsmaße. 250
10.1.2 Streuungsmaße. 251
10.1.3 Korrelationsmaße. 255
10.2 Prüfstatistik. 256
10.2.1 Skalen und ihre Daten. 256
10.2.2 Skizze des Ablaufs einer wissenschaftlichen Untersuchung. 257
10.2.3 Die Wahl eines geeigneten Signifikanztests. 260
Inhaltsverzeichnis ■
XI
11 Naturwissenschaft
vs.
Übernatürliches. 267
Anhang 1: CD-Antigene. 268
Anhang 2: Cytokine. 287
Anhang 3: Chemokine. 291
Glossar . 294
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