Einfluss von Isolations- und Kulturprotokollen auf in-vitro-Charakteristika synovialer Fibroblasten:
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2008
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis 1
Abkürzungsverzeichnis 3
1. Einleitung 5
1.1 Hintergrund 5
1.1.1 Immunkompetente Zellen als Auslöser der Rheumatoid Arthritis 6
1.1.2 Synoviale Fibroblasten als Auslöser der Rheumatoid Arthritis 6
1.2 Auswahl der untersuchten Parameter 8
1.3 Zielsetzung 9
2. Material und Methoden 11
2.1 Patienten und Gewebe 12
2.2 Allgemeine Zellkulturbedingungen 13
2.2.1 Passagieren der Zellen 13
2.2.2 Zellzahlbestimmung mittels Neubauer-Kammer 14
2.2.3 Ausschluss von Infektionen 14
2.3 Isolation von Fibroblasten 14
2.3.1 Gewebeverdau der RA-/OA-Synovialmembran 14
2.3.2 Gewebeverdau der gesunden Haut 15
2.3.3 Primäre positive Isolation 15
2.3.4 Primäre negative Isolation 17
2.3.5 Isolation durch Auswachsen 17
2.4 Konventionelle Kultur isolierter Fibroblasten in Mikrotiterplatten 18
2.5 3D-Kultur isolierter Fibroblasten im Kollagengel 18
2 ß Charakterisierung der Fibroblasten-
präparation mittels Durchflusszytometrie 20
2.6.1 Detektion von Oberflächenantigenen 20
2.6.2 Detektion zytoplasmatischer Antigene 20
2.7 Nachweis von sezernierten Zellprodukten 21
2.7.1 Zytokin-Nachweis 21
2.7.2 MMP-Nachweis 21
2.8 Nachweis von Genexpression 22
2.8.1 RNA-Extraktion 22
2.8.2 Konzentrations- und Integritätsbestimmung der RNA-Extraktion 22
2.8.3 Fällung der RNA 23
2.8.4 Reverse Transkription der RNA in cDNA 24
2.8.5 Semiquantitative PCR mittels LightCycler 24
2.8.6 Gelelektrophorese 27
2.9 Statistische Auswertung der Daten 28
3. Ergebnisse _ _ ___ 29
3.1 Isolationsmethoden 29
3 2 Charakterisierung der Fibroblasten-
präparation mittels Durchflusszytometrie 30
3.3 Kontraktion von Kollagengelen durch Fibroblasten 33
3.4 Nachweis von Zellprodukten nach Kultur 34
3.4.1 Nachweis von Zellprodukten auf Proteinebene im Überstand 34
3 4 2 Nachweis von Zellprodukten auf RNA-
Ebene mittels semiquantitativer PCR 44
4. Diskussion 50
4.1 Auswahl der Patienten und Gewebe 50
4.2 Vergleich verschiedener Isolationsmethoden 51
4.2.1 Wahl der Isolationsmethoden 51
4.2.2 Reinheit der unterschiedlich isolierten Fibroblasten 53
423 Einfluss der Isolationsmethode auf die
Zytokinproduktion synovialer Fibroblasten 55
4 2 4 Einfluss der Isolationsmethode auf die
Produktion von MMPs synovialer Fibroblasten 57
4.3 Einfluss der in v/Yro-Kultur auf Fibroblastenfunktionen 60
4.3.1 Gelkontraktion 61
4 3 2 Einfluss der Kulturbedingungen auf die
Zytokinproduktion synovialer Fibroblasten 62
433 Einfluss der Kulturbedingungen auf die
Produktion von MMPs synovialer Fibroblasten 63
4 4 Vergleichende Zusammenfallung
von RNA- versus Proteinbefunden 64
4 r Vorschlag eines optimierten, in vzvo-nahen Isolations¬
und Kulturmodells für synoviale RA-Fibroblasten 65
5. Zusammenfassung _______ 69
6. Literaturverzeichnis 71
Anhang _ _______ 82
|
| adam_txt |
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis 1
Abkürzungsverzeichnis 3
1. Einleitung 5
1.1 Hintergrund 5
1.1.1 Immunkompetente Zellen als Auslöser der Rheumatoid Arthritis 6
1.1.2 Synoviale Fibroblasten als Auslöser der Rheumatoid Arthritis 6
1.2 Auswahl der untersuchten Parameter 8
1.3 Zielsetzung 9
2. Material und Methoden 11
2.1 Patienten und Gewebe 12
2.2 Allgemeine Zellkulturbedingungen 13
2.2.1 Passagieren der Zellen 13
2.2.2 Zellzahlbestimmung mittels Neubauer-Kammer 14
2.2.3 Ausschluss von Infektionen 14
2.3 Isolation von Fibroblasten 14
2.3.1 Gewebeverdau der RA-/OA-Synovialmembran 14
2.3.2 Gewebeverdau der gesunden Haut 15
2.3.3 Primäre positive Isolation 15
2.3.4 Primäre negative Isolation 17
2.3.5 Isolation durch Auswachsen 17
2.4 Konventionelle Kultur isolierter Fibroblasten in Mikrotiterplatten 18
2.5 3D-Kultur isolierter Fibroblasten im Kollagengel 18
2 ß Charakterisierung der Fibroblasten-
präparation mittels Durchflusszytometrie 20
2.6.1 Detektion von Oberflächenantigenen 20
2.6.2 Detektion zytoplasmatischer Antigene 20
2.7 Nachweis von sezernierten Zellprodukten 21
2.7.1 Zytokin-Nachweis 21
2.7.2 MMP-Nachweis 21
2.8 Nachweis von Genexpression 22
2.8.1 RNA-Extraktion 22
2.8.2 Konzentrations- und Integritätsbestimmung der RNA-Extraktion 22
2.8.3 Fällung der RNA 23
2.8.4 Reverse Transkription der RNA in cDNA 24
2.8.5 Semiquantitative PCR mittels LightCycler 24
2.8.6 Gelelektrophorese 27
2.9 Statistische Auswertung der Daten 28
3. Ergebnisse _ _ _ 29
3.1 Isolationsmethoden 29
3 2 Charakterisierung der Fibroblasten-
präparation mittels Durchflusszytometrie 30
3.3 Kontraktion von Kollagengelen durch Fibroblasten 33
3.4 Nachweis von Zellprodukten nach Kultur 34
3.4.1 Nachweis von Zellprodukten auf Proteinebene im Überstand 34
3 4 2 Nachweis von Zellprodukten auf RNA-
Ebene mittels semiquantitativer PCR 44
4. Diskussion 50
4.1 Auswahl der Patienten und Gewebe 50
4.2 Vergleich verschiedener Isolationsmethoden 51
4.2.1 Wahl der Isolationsmethoden 51
4.2.2 Reinheit der unterschiedlich isolierten Fibroblasten 53
423 Einfluss der Isolationsmethode auf die
Zytokinproduktion synovialer Fibroblasten 55
4 2 4 Einfluss der Isolationsmethode auf die
Produktion von MMPs synovialer Fibroblasten 57
4.3 Einfluss der in v/Yro-Kultur auf Fibroblastenfunktionen 60
4.3.1 Gelkontraktion 61
4 3 2 Einfluss der Kulturbedingungen auf die
Zytokinproduktion synovialer Fibroblasten 62
433 Einfluss der Kulturbedingungen auf die
Produktion von MMPs synovialer Fibroblasten 63
4 4 Vergleichende Zusammenfallung
von RNA- versus Proteinbefunden 64
4 r Vorschlag eines optimierten, in vzvo-nahen Isolations¬
und Kulturmodells für synoviale RA-Fibroblasten 65
5. Zusammenfassung _ 69
6. Literaturverzeichnis 71
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