Untersuchung der Genexpression von zellulären Nukleosidkinasen in peripheren mononukleären Blutzellen: vergleichende Analyse der Genexpression mit Hilfe der RT-PCR bei HIV-1-infizierten Patienten und nicht infizierten Spendern
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2006
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis 6
Tabellenverzeichnis 9
Abkürzungsverzeichnis 10
1. Einleitung 12
1.1. Entdeckung von HIV-1 und HIV-2 12
1.2. Epidemiologie 13
1.3. Morphologie von HIV-1 13
1.4. Genomorganisation von HIV-1 14
1.5. Infektionszyklus 15
1.6. Übertragungswege 18
1.7. Klinik 18
1.8. Antiretrovirale Therapie 19
1.8.1. Nukleosidale Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NRTI) 20
1.8.2. Nicht Nukleosidale Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI) 22
1.8.3. Nukleotidale Reverse Transkriptase-Hemmer (NtRT) 23
1.8.4. Proteaseinhibitoren (Pl) 23
1.8.5. Fusionsinhibitoren 23
1.8.6. Neue Substanzgruppen 24
1.9. Therapieversagen durch Resistenzentwicklung auf viraler und zellulärer
Ebene 24
2. Fragestellung 28
3. Material und Methoden 29
3.1. Material 29
3.1.1. Chemikalien 29
3.1.2. Stammlösungen 30
3.1.3. Verbrauchsmaterialien 30
3.1.4. Testkits 31
3.1.5. Geräte 31
3.1.6. PC-Programme 31
-1-
3.2. Arbeiten mit infektiösem Material 31
3.3. Isolierung von peripheren mononukleären Zellen aus Blut 32
3.4. Kultivierung von mononukleären Zellen aus peripherem Blut 33
3.5. RNA Isolation 34
3.5.1. Phasentrennung 34
3.5.2. RNA-Präzipitation 34
3.5.3. Waschen der RNA 34
3.5.4. RNA resuspendieren 35
3.5.5. Optische Messung mit dem Gene Quant II 35
3.5.6. Berechnung der RNA Konzentration der Lösung 35
3.6. Reverse Transkription der mRNA zu cDNA 35
3.7. Semiquantitative RT-PCR zum Nachweis von zellulären Resistenzfaktoren
37
3.8. Polymerase Kettenreaktion (PCR): Amplifikation der cDNA mittels PCR. 38
3.8.1. Amplifikation der zu untersuchenden Genabschnitte 38
3.8.2. Amplifikation des Standards GAPDH 40
3.9. Gelelektrophorese der PCR Amplifikate 40
3.10. Statistische Methoden 41
3.10.1. Bivariate und multivariate Merkmalsausprägungen 41
3.10.2. Korrelationsanalyse 42
3.10.3. Korrelationskoeffizient nach Bravais-Pearson 42
3.10.4. Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman 43
3.10.5. Regressionsanalyse 44
3.10.6. Statistische Testverfahren für unverbundene Stichproben 44
3.10.7. Welch-Test 45
3.10.8. U-Test von Wilcoxon / Mann / Whitney 46
4. Ergebnisteil 48
4.1. Darstellung der Gesamtstichprobe sowie deren Abschichtungen 48
4.1.1. Gesamtstichprobe ( Auswertung 1 ) 48
4.1.1.1. HIV-positive Proben 48
4.1.1.2. HIV-negative Proben 51
4.1.2. Gesamtstichprobe bereinigt um die Extremwerte (Auswertung 2 ) 52
4.1.3. Stichprobe aller Probanden mit Compliance (Auswertung 3 ) 53
-2-
4.1.4. Stichprobe aller therapierelevanten Probanden („Auswertung 4 ) 54
4.2. Unterteilung der HIV-positiven Stichproben in Teilstichproben 54
4.3. Bestimmung der Nukleosid-Kinasen mRNA-Expression in PBMC s von
HIV-positiven und negativen Spendern 55
4.4. Nukleosid-Diphosphat-Kinase(NDK) 58
4.4.1. Kurzbeschreibung NDK 58
4.4.2. Gesamtstichprobe (Auswertung 1) 59
4.4.2.1. Auswertung nicht stimulierte versus stimulierte Proben 59
4.4.2.2. Punktediagramm 61
4.4.2.3. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 62
4.4.2.4. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 64
4.4.3. Gesamtstichprobe bereinigt um Extremwerte (Auswertung 2) 65
4.4.3.1. Punktediagramm 65
4.4.3.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 65
4.4.3.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 68
4.4.4. Stichprobe aller Probanden mit Compliance (Auswertung 3) 69
4.4.4.1. Punktediagramm 69
4.4.4.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 70
4.4.4.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 72
4.4.5. Stichprobe aller therapierelevanten Proben (Auswertung 4) 73
4.4.5.1. Punktediagramm 73
4.4.5.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 73
4.4.5.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 76
4.4.5.4. Zusammenfassung der Ergebnisauswertung 76
4.5. Thymidin-Kinase (TK) 77
4.5.1. Kurzbeschreibung TK 77
4.5.2. Gesamtstichprobe (Auswertung 1) 78
4.5.2.1. Auswertung nicht stimulierte versus stimulierte Proben 78
4.5.2.2. Punktediagramm 79
4.5.2.3. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 80
4.5.2.4. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 83
4.5.3. Gesamtstichprobe bereinigt um Extremwerte (Auswertung 2) 83
4.5.3.1. Punktediagramm 83
4.5.3.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 84
-3-
4.5.3.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 87
4.5.4. Stichprobe aller Probanden mit Compliance (Auswertung 3) 87
4.5.4.1. Punktediagramm 87
4.5.4.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 88
4.5.4.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 90
4.5.5. Stichprobe aller therapierelevanten Proben (Auswertung 4) 90
4.5.5.1. Punktediagramm 90
4.5.5.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 91
4.5.5.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 94
4.5.5.4. Zusammenfassung der Ergebnisauswertung 94
4.6. Deoxycytidin-Kinase (dCK) 95
4.6.1. Kurzbeschreibung dCK 95
4.6.2. Gesamtstichprobe (Auswertung 1) 95
4.6.2.1. Auswertung nicht stimulierte versus stimulierte Proben 95
4.6.2.2. Punktediagramm 96
4.6.2.3. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 97
4.6.2.4. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 100
4.6.3. Gesamtstichprobe bereinigt um Extremwerte (Auswertung 2) 100
4.6.3.1. Punktediagramm 100
4.6.3.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 101
4.6.3.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 1°4
4.6.4. Stichprobe aller Probanden mit Compliance (Auswertung 3) 104
4.6.4.1. Punktediagramm 104
4.6.4.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 105
4.6.4.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 1°7
4.6.5. Stichprobe aller therapierelevanten Proben (Auswertung 4) 1°7
4.6.5.1. Punktediagramm 107
4.6.5.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 108
4.6.5.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 11°
4.6.5.4. Zusammenfassung der Ergebnisauswertung 111
5. Diskussion 112
5.1. Resistenzen und Therapieversagen 112
5.2. Zelluläre Resistenzmechanismen 113
-4-
5.3. Ergebnisse für jede einzelne Kinase 114
5.3.1. Nucleosid-Diphosphat-Kinase(NDK) 114
5.3.2. Thymidin-Kinase (TK) 116
5.3.3. Dideoxycytidin-Kinase (dCK) 118
5.4. Ausblick 120
6. Zusammenfassung 122
7. Summary 124
Literaturverzeichnis 126
Anhang 148
1. Auswertungsdaten 149
1.1. HIV-positive Spender 149
1.2. HIV-negative Spender 152
2. Statistische Auswertungsergebnisse 153
2.1. Relative Mittelwertabweichung 153
2.2. Spearman-Rangkorrelationskoeffizient 154
2.3. Regressionsanalyse 155
2.4. Welch-Test 156
2.4.1. Auswertung 1 156
2.4.2. Auswertung 2 158
2.4.3. Auswertung 3 160
2.4.4. Auswertung 4 162
2.5. U-Test 164
AUSBILDUNG 166
STUDIUM 166
-5-
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis 6
Tabellenverzeichnis 9
Abkürzungsverzeichnis 10
1. Einleitung 12
1.1. Entdeckung von HIV-1 und HIV-2 12
1.2. Epidemiologie 13
1.3. Morphologie von HIV-1 13
1.4. Genomorganisation von HIV-1 14
1.5. Infektionszyklus 15
1.6. Übertragungswege 18
1.7. Klinik 18
1.8. Antiretrovirale Therapie 19
1.8.1. Nukleosidale Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NRTI) 20
1.8.2. Nicht Nukleosidale Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI) 22
1.8.3. Nukleotidale Reverse Transkriptase-Hemmer (NtRT) 23
1.8.4. Proteaseinhibitoren (Pl) 23
1.8.5. Fusionsinhibitoren 23
1.8.6. Neue Substanzgruppen 24
1.9. Therapieversagen durch Resistenzentwicklung auf viraler und zellulärer
Ebene 24
2. Fragestellung 28
3. Material und Methoden 29
3.1. Material 29
3.1.1. Chemikalien 29
3.1.2. Stammlösungen 30
3.1.3. Verbrauchsmaterialien 30
3.1.4. Testkits 31
3.1.5. Geräte 31
3.1.6. PC-Programme 31
-1-
3.2. Arbeiten mit infektiösem Material 31
3.3. Isolierung von peripheren mononukleären Zellen aus Blut 32
3.4. Kultivierung von mononukleären Zellen aus peripherem Blut 33
3.5. RNA Isolation 34
3.5.1. Phasentrennung 34
3.5.2. RNA-Präzipitation 34
3.5.3. Waschen der RNA 34
3.5.4. RNA resuspendieren 35
3.5.5. Optische Messung mit dem Gene Quant II 35
3.5.6. Berechnung der RNA Konzentration der Lösung 35
3.6. Reverse Transkription der mRNA zu cDNA 35
3.7. Semiquantitative RT-PCR zum Nachweis von zellulären Resistenzfaktoren
37
3.8. Polymerase Kettenreaktion (PCR): Amplifikation der cDNA mittels PCR. 38
3.8.1. Amplifikation der zu untersuchenden Genabschnitte 38
3.8.2. Amplifikation des Standards GAPDH 40
3.9. Gelelektrophorese der PCR Amplifikate 40
3.10. Statistische Methoden 41
3.10.1. Bivariate und multivariate Merkmalsausprägungen 41
3.10.2. Korrelationsanalyse 42
3.10.3. Korrelationskoeffizient nach Bravais-Pearson 42
3.10.4. Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman 43
3.10.5. Regressionsanalyse 44
3.10.6. Statistische Testverfahren für unverbundene Stichproben 44
3.10.7. Welch-Test 45
3.10.8. U-Test von Wilcoxon / Mann / Whitney 46
4. Ergebnisteil 48
4.1. Darstellung der Gesamtstichprobe sowie deren Abschichtungen 48
4.1.1. Gesamtstichprobe ("Auswertung 1") 48
4.1.1.1. HIV-positive Proben 48
4.1.1.2. HIV-negative Proben 51
4.1.2. Gesamtstichprobe bereinigt um die Extremwerte (Auswertung 2") 52
4.1.3. Stichprobe aller Probanden mit Compliance (Auswertung 3") 53
-2-
4.1.4. Stichprobe aller therapierelevanten Probanden („Auswertung 4") 54
4.2. Unterteilung der HIV-positiven Stichproben in Teilstichproben 54
4.3. Bestimmung der Nukleosid-Kinasen mRNA-Expression in PBMC's von
HIV-positiven und negativen Spendern 55
4.4. Nukleosid-Diphosphat-Kinase(NDK) 58
4.4.1. Kurzbeschreibung NDK 58
4.4.2. Gesamtstichprobe (Auswertung 1) 59
4.4.2.1. Auswertung nicht stimulierte versus stimulierte Proben 59
4.4.2.2. Punktediagramm 61
4.4.2.3. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 62
4.4.2.4. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 64
4.4.3. Gesamtstichprobe bereinigt um Extremwerte (Auswertung 2) 65
4.4.3.1. Punktediagramm 65
4.4.3.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 65
4.4.3.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 68
4.4.4. Stichprobe aller Probanden mit Compliance (Auswertung 3) 69
4.4.4.1. Punktediagramm 69
4.4.4.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 70
4.4.4.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 72
4.4.5. Stichprobe aller therapierelevanten Proben (Auswertung 4) 73
4.4.5.1. Punktediagramm 73
4.4.5.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 73
4.4.5.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 76
4.4.5.4. Zusammenfassung der Ergebnisauswertung 76
4.5. Thymidin-Kinase (TK) 77
4.5.1. Kurzbeschreibung TK 77
4.5.2. Gesamtstichprobe (Auswertung 1) 78
4.5.2.1. Auswertung nicht stimulierte versus stimulierte Proben 78
4.5.2.2. Punktediagramm 79
4.5.2.3. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 80
4.5.2.4. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 83
4.5.3. Gesamtstichprobe bereinigt um Extremwerte (Auswertung 2) 83
4.5.3.1. Punktediagramm 83
4.5.3.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 84
-3-
4.5.3.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 87
4.5.4. Stichprobe aller Probanden mit Compliance (Auswertung 3) 87
4.5.4.1. Punktediagramm 87
4.5.4.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 88
4.5.4.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 90
4.5.5. Stichprobe aller therapierelevanten Proben (Auswertung 4) 90
4.5.5.1. Punktediagramm 90
4.5.5.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 91
4.5.5.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 94
4.5.5.4. Zusammenfassung der Ergebnisauswertung 94
4.6. Deoxycytidin-Kinase (dCK) 95
4.6.1. Kurzbeschreibung dCK 95
4.6.2. Gesamtstichprobe (Auswertung 1) 95
4.6.2.1. Auswertung nicht stimulierte versus stimulierte Proben 95
4.6.2.2. Punktediagramm 96
4.6.2.3. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 97
4.6.2.4. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 100
4.6.3. Gesamtstichprobe bereinigt um Extremwerte (Auswertung 2) 100
4.6.3.1. Punktediagramm 100
4.6.3.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 101
4.6.3.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 1°4
4.6.4. Stichprobe aller Probanden mit Compliance (Auswertung 3) 104
4.6.4.1. Punktediagramm 104
4.6.4.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 105
4.6.4.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 1°7
4.6.5. Stichprobe aller therapierelevanten Proben (Auswertung 4) 1°7
4.6.5.1. Punktediagramm 107
4.6.5.2. Analyse der Minima, der Maxima, der Mittelwerte und der Streuung 108
4.6.5.3. Vergleich der Mittelwerte der unverbundenen Stichprobe 11°
4.6.5.4. Zusammenfassung der Ergebnisauswertung 111
5. Diskussion 112
5.1. Resistenzen und Therapieversagen 112
5.2. Zelluläre Resistenzmechanismen 113
-4-
5.3. Ergebnisse für jede einzelne Kinase 114
5.3.1. Nucleosid-Diphosphat-Kinase(NDK) 114
5.3.2. Thymidin-Kinase (TK) 116
5.3.3. Dideoxycytidin-Kinase (dCK) 118
5.4. Ausblick 120
6. Zusammenfassung 122
7. Summary 124
Literaturverzeichnis 126
Anhang 148
1. Auswertungsdaten 149
1.1. HIV-positive Spender 149
1.2. HIV-negative Spender 152
2. Statistische Auswertungsergebnisse 153
2.1. Relative Mittelwertabweichung 153
2.2. Spearman-Rangkorrelationskoeffizient 154
2.3. Regressionsanalyse 155
2.4. Welch-Test 156
2.4.1. Auswertung 1 156
2.4.2. Auswertung 2 158
2.4.3. Auswertung 3 160
2.4.4. Auswertung 4 162
2.5. U-Test 164
AUSBILDUNG 166
STUDIUM 166
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| spelling | Matthes-Weinmann, Julia 1977- Verfasser (DE-588)134079973 aut Untersuchung der Genexpression von zellulären Nukleosidkinasen in peripheren mononukleären Blutzellen vergleichende Analyse der Genexpression mit Hilfe der RT-PCR bei HIV-1-infizierten Patienten und nicht infizierten Spendern vorgelegt von Julia Matthes-Weinmann 2006 168 S. Ill., graph. Darst. 21 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2008 (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content HBZ Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=016528729&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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