Analyse der Signal- und Aktivierungswege bei oxidativem Stress sowie anti-oxidative Intervention über extrakorporale Blutbehandlungsverfahren:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Düsseldorf
VDI-Verl.
2008
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| Ausgabe: | Als Ms. gedr. |
| Schriftenreihe: | Fortschritt-Berichte VDI
Reihe 17, Biotechnik/Medizintechnik ; 271 |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Diss. |
| Beschreibung: | XII, 166 S. Ill., graph. Darst. |
| ISBN: | 9783183271177 |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis VIII
Summary X
1. Einleitung und Motivation 1
2. Stand des Wissens 4
2.1 Entstehung reaktiver Sauerstoff- Spezies 4
2.2 Antioxidative Schutzsysteme 8
2.3 Oxidativer Stress 10
2.4 Aktivierung der Immunantwort und Signaltransduktion 11
2.4.1 Spezifische und unspezifische Immunantwort 11
2.4.2 Signaltransduktion nach Zellaktivierung 12
2.5 Pathophysiologie des oxidativen Stresses 15
2.5.1 Oxidativer Stress bei Nierenversagen 15
2.5.1.1 Oxidativer Stress bei chronischer Nieren-Insuffizienz 15
2.5.1.2 Oxidativer Stress bei akutem Nierenversagen 18
2.5.2 Oxidativer Stress bei akutem Leberversagen 19
2.5.2.1 Paracetamolvergiftung 19
2.5.2.2 Ischämie-Reperfusionsschaden 19
3. Material und Methoden 21
3.1 in vitro Modellsystem 21
3.1.1 Präparation frischer humaner Blutzellen 21
3.1.2 Induzierung des oxidativen Stresses 21
3.1.2.1 Phorbol-Myristat-Acetat 21
3.1.2.2 Lipopolysaccharid 22
3.1.3 Bestimmung von Lebendzellzahl und Vitalität 23
3.1.4 Protektions-und Interventions-Modus 23
3.2 Methoden 23
3.2.1 Messung reaktiver Sauerstoff Spezies (ROS) 23
3.2.2 Durchflußzytometrie 24
3.2.2.1 Messung von Oberflächenadhäsionsmarkern 24
3.2.2.2 Messung der Phagozytose- Eigenschaften 25
3.2.3 ELISA 26
3.2.4 SDS-PAGE (Western Blot) 26
3.2.4.1 Probenvorbereitung 26
3.2.4.2 Elektrophorese 27
3.2.4.3 Blotting 27
3.2.4.4 Immundetektion 27
3.2.5 DNA-Microarray 28
3.2.5.1 RNA-Isolierung 29
3.2.5.2 DNA-Microarrays Fa. SIRS-Lab 31
3.2.5.3 cDNA-Synthese und Fluoreszenzmarkierung 31
V
Inhaltsverzeichnis
3.2.5.4 Hydrolyse der RNA 32
3.2.5.5 Labein 32
3.2.5.6 Aufreinigung der markierten DNA J2
3.2.5.7 Hybridisierung ^
3.2.5.8 Waschen 33
3 2 5 9 Scannen und Auswerten der Microarrays
..34
33 Biomarker des oxidativen Stresses 34
3.3.1 Oxidation von Plasma Proteinen 35
3.3.2 Glutathion-Redoxsystem
r 3o
3.4 Substanzen 36
3.4.1 Vitamin C 36
3.4.2 Glutathion 38
3.4.3 Glukonsäure 3g
3.4.4 N-Acetyl-Cystein
3.5 Statistische Versuchsplanung 39
3.5.1 Methodik der statistischen Versuchsplanung 40
3.5.2 Versuchsplanung 40
3.5.2.1 Vollfaktorielle Versuchspläne 41
3.5.2.2 CCD-Versuchspläne
41
3.6 Materialien
3.7 Statistik
46
4. Ergebnisse der in vitro Untersuchungen
.... 4o
4.1 Entstehung und Inhibierung freier Sauerstoffradikale 46
4.1.1 Kinetik der ROS Freisetzung 50
4.1.2 Screening antioxidativ-wirksamer Substanzen 52
4.1.3 Vergleich von Protektion und Intervention • 57
4.1.4 Screening von Kombinationen mittels statistischer Versuchsplanung ¦¦¦ ^
4.1.5 Vergleich der Kombinationen zu Einzelsubstanzen
60
4.2 Zelluläre Signalkette: Trankriptionsfaktor NF-kB 66
4.2.1 Kinetik der NF-kB-Aktivierung ; gg
4.2.2 Inhibierung der NF-kB- Aktivierung durch N-Acetyl-Cystein
67
4.3 Untersuchung des Genexpressionsprofils 69
4.3.1 Experimenteller Setup und Versuchsplan 70
4.3.2 Rohdaten und Qualitätskontrolle der Ergebnisse 75
4.3.3 Statistische Analyse der Microarray Daten V 7g
4.3.3.1 Einfluss der LPS Stimulierung auf das Genexpressionsproti • gg
4.3.3.2 Einfluss von N-Acetyl-Cystein vor LPS- Induktion • g9
4.3.3.3 Einfluss von N-Acetyl-Cystein nach LPS- Induktion ¦ ¦ 92
4.3.3.4 Vergleich zwischen Prävention und Intervention •¦••_ 93
4.3.3.5 Regulierung in Relation zur Kontrolle und LPS- Induktion
4.4 Einfluss von N-Acetyl-Cystein auf die Expression von CD1 lb
4.5 Untersuchung der Phagozytose in Abhängigkeit von NAC
4.6 Einfluss von NAC auf die IL6- Expression j
4.7 Diskussion der in vitro Untersuchungen 101
4.7.1 In vitro Modelt zur Entstehung freier Sauerstoffradikale
VI
Inhaltsverzeichnis
4.7.2 Inhibition freier Sauerstoffradikale 102
4.7.2.1 N-Acetylcystein 102
4.7.2.2 Vitamin C 103
4.7.2.3 Glutathion 103
4.7.2.4 Glukonsäure 104
4.7.2.5 Kombination der untersuchten Substanzen 104
4.7.3 Aktivierung NF-kB Signalweg und Einfluss von NAC 104
4.7.4 Untersuchungen zur Genexpression 106
4.7.4.1 Genexpressionsanalyse LPS- induzierter Leukozyten 106
4.7.4.2 Einfluss von NAC nach LPS- Induktion 107
4.7.4.3 Unterschied zwischen Prävention und Intervention 108
4.7.5 Oberflächenadäsionsmarker 109
4.7.6 Phagozytose 110
4.7.7 Interleukin 6 110
5. Technische und klinische Ableitungen 111
5.1 In vivo Pilotstudie: Modifizierung des Dialysats mit Glukonsäure 111
5.1.1 Konzeption der Studie 112
5.1.2 Ergebnisse der Glukonsäure-Studie 112
5.2 Konzeption einer anti-oxidativen Therapie mit N-Acetyl-Cystein 114
5.2.1 Modellierung der Pharmakokinetik von NAC in der Hämodialyse 115
5.2.1.1 Intravenöse Bolus- Injektion von NAC 115
5.2.1.2 Extrakorporaler Blutkreislauf bei HD-Patienten 117
5.2.1.3 Untersuchung zur Akkumulation von NAC bei HD- Patienten... 120
5.2.2 Klinische Konzeption: Therapievorschlag 122
5.2.3 Entwurf der klinischen Pilotstudie 124
5.2.4 Technische Konzeption: NAC in der Hämodialyse 125
5.2.4.1 Acetylcystein als Additiv im Dialysat 125
5.2.4.2 N-Acetylcystein als Infusion 128
5.2.5 Technische Integration von NAC in der Dialysebehandlung 129
5.2.5.1 Physikalische und chemische Eigenschaften von NAC 129
5.2.5.2 NAC in Lösung 130
5.2.5.3 NAC als Pulver/Granulat 130
5.3 In vivo Pilotstudie: Akutes Leberversagen im Schwein 131
5.4 Diskussion der Ergebnisse 135
5.4.1 Glukonsäure im Dialysat 135
5.4.2 Konzeption einer integrierten Behandlung mit NAC in der Hämodialyse. 135
5.4.3 Oxidativer Stress bei akutem Leberversagen 138
5.4.3.1 Oxidativer Stress bei totaler Hepatektomie 138
5.4.3.2 Oxidativer Stress bei Amanitin-Vergiftung 138
5.4.3.3 Oxidativer Stress bei Ischämie/ Reperfusionsschädigung 139
5.4.3.4 Oxidativer Stress bei Paracetamol-Vergiftung 139
6. Zusammenfassung 140
; Anhang 143
Literaturverzeichnis 148
1 Vtl
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis VIII
Summary X
1. Einleitung und Motivation 1
2. Stand des Wissens 4
2.1 Entstehung reaktiver Sauerstoff- Spezies 4
2.2 Antioxidative Schutzsysteme 8
2.3 Oxidativer Stress 10
2.4 Aktivierung der Immunantwort und Signaltransduktion 11
2.4.1 Spezifische und unspezifische Immunantwort 11
2.4.2 Signaltransduktion nach Zellaktivierung 12
2.5 Pathophysiologie des oxidativen Stresses 15
2.5.1 Oxidativer Stress bei Nierenversagen 15
2.5.1.1 Oxidativer Stress bei chronischer Nieren-Insuffizienz 15
2.5.1.2 Oxidativer Stress bei akutem Nierenversagen 18
2.5.2 Oxidativer Stress bei akutem Leberversagen 19
2.5.2.1 Paracetamolvergiftung 19
2.5.2.2 Ischämie-Reperfusionsschaden 19
3. Material und Methoden 21
3.1 in vitro Modellsystem 21
3.1.1 Präparation frischer humaner Blutzellen 21
3.1.2 Induzierung des oxidativen Stresses 21
3.1.2.1 Phorbol-Myristat-Acetat 21
3.1.2.2 Lipopolysaccharid 22
3.1.3 Bestimmung von Lebendzellzahl und Vitalität 23
3.1.4 Protektions-und Interventions-Modus 23
3.2 Methoden 23
3.2.1 Messung reaktiver Sauerstoff Spezies (ROS) 23
3.2.2 Durchflußzytometrie 24
3.2.2.1 Messung von Oberflächenadhäsionsmarkern 24
3.2.2.2 Messung der Phagozytose- Eigenschaften 25
3.2.3 ELISA 26
3.2.4 SDS-PAGE (Western Blot) 26
3.2.4.1 Probenvorbereitung 26
3.2.4.2 Elektrophorese 27
3.2.4.3 Blotting 27
3.2.4.4 Immundetektion 27
3.2.5 DNA-Microarray 28
3.2.5.1 RNA-Isolierung 29
3.2.5.2 DNA-Microarrays Fa. SIRS-Lab 31
3.2.5.3 cDNA-Synthese und Fluoreszenzmarkierung 31
V
Inhaltsverzeichnis
3.2.5.4 Hydrolyse der RNA 32
3.2.5.5 Labein 32
3.2.5.6 Aufreinigung der markierten DNA J2
3.2.5.7 Hybridisierung ^
3.2.5.8 Waschen 33
3 2 5 9 Scannen und Auswerten der Microarrays
.34
33 Biomarker des oxidativen Stresses 34
3.3.1 Oxidation von Plasma Proteinen 35
3.3.2 Glutathion-Redoxsystem
r 3o
3.4 Substanzen 36
3.4.1 Vitamin C 36
3.4.2 Glutathion ''38
3.4.3 Glukonsäure 3g
3.4.4 N-Acetyl-Cystein
3.5 Statistische Versuchsplanung 39
3.5.1 Methodik der statistischen Versuchsplanung 40
3.5.2 Versuchsplanung 40
3.5.2.1 Vollfaktorielle Versuchspläne '41
3.5.2.2 CCD-Versuchspläne
41
3.6 Materialien
3.7 Statistik
46
4. Ergebnisse der in vitro Untersuchungen
. 4o
4.1 Entstehung und Inhibierung freier Sauerstoffradikale 46
4.1.1 Kinetik der ROS Freisetzung 50
4.1.2 Screening antioxidativ-wirksamer Substanzen 52
4.1.3 Vergleich von Protektion und Intervention • 57
4.1.4 Screening von Kombinationen mittels statistischer Versuchsplanung ¦¦¦ ^
4.1.5 Vergleich der Kombinationen zu Einzelsubstanzen
60
4.2 Zelluläre Signalkette: Trankriptionsfaktor NF-kB 66
4.2.1 Kinetik der NF-kB-Aktivierung ; gg
4.2.2 Inhibierung der NF-kB- Aktivierung durch N-Acetyl-Cystein
67
4.3 Untersuchung des Genexpressionsprofils 69
4.3.1 Experimenteller Setup und Versuchsplan 70
4.3.2 Rohdaten und Qualitätskontrolle der Ergebnisse 75
4.3.3 Statistische Analyse der Microarray Daten "V" 7g
4.3.3.1 Einfluss der LPS Stimulierung auf das Genexpressionsproti • gg
4.3.3.2 Einfluss von N-Acetyl-Cystein vor LPS- Induktion • g9
4.3.3.3 Einfluss von N-Acetyl-Cystein nach LPS- Induktion ¦ ¦ 92
4.3.3.4 Vergleich zwischen Prävention und Intervention •¦••_ 93
4.3.3.5 Regulierung in Relation zur Kontrolle und LPS- Induktion
4.4 Einfluss von N-Acetyl-Cystein auf die Expression von CD1 lb
4.5 Untersuchung der Phagozytose in Abhängigkeit von NAC
4.6 Einfluss von NAC auf die IL6- Expression j
4.7 Diskussion der in vitro Untersuchungen 101
4.7.1 In vitro Modelt zur Entstehung freier Sauerstoffradikale
VI
Inhaltsverzeichnis
4.7.2 Inhibition freier Sauerstoffradikale 102
4.7.2.1 N-Acetylcystein 102
4.7.2.2 Vitamin C 103
4.7.2.3 Glutathion 103
4.7.2.4 Glukonsäure 104
4.7.2.5 Kombination der untersuchten Substanzen 104
4.7.3 Aktivierung NF-kB Signalweg und Einfluss von NAC 104
4.7.4 Untersuchungen zur Genexpression 106
4.7.4.1 Genexpressionsanalyse LPS- induzierter Leukozyten 106
4.7.4.2 Einfluss von NAC nach LPS- Induktion 107
4.7.4.3 Unterschied zwischen Prävention und Intervention 108
4.7.5 Oberflächenadäsionsmarker 109
4.7.6 Phagozytose 110
4.7.7 Interleukin 6 110
5. Technische und klinische Ableitungen 111
5.1 In vivo Pilotstudie: Modifizierung des Dialysats mit Glukonsäure 111
5.1.1 Konzeption der Studie 112
5.1.2 Ergebnisse der Glukonsäure-Studie 112
5.2 Konzeption einer anti-oxidativen Therapie mit N-Acetyl-Cystein 114
5.2.1 Modellierung der Pharmakokinetik von NAC in der Hämodialyse 115
5.2.1.1 Intravenöse Bolus- Injektion von NAC 115
5.2.1.2 Extrakorporaler Blutkreislauf bei HD-Patienten 117
5.2.1.3 Untersuchung zur Akkumulation von NAC bei HD- Patienten. 120
5.2.2 Klinische Konzeption: Therapievorschlag 122
5.2.3 Entwurf der klinischen Pilotstudie 124
5.2.4 Technische Konzeption: NAC in der Hämodialyse 125
5.2.4.1 Acetylcystein als Additiv im Dialysat 125
5.2.4.2 N-Acetylcystein als Infusion 128
5.2.5 Technische Integration von NAC in der Dialysebehandlung 129
5.2.5.1 Physikalische und chemische Eigenschaften von NAC 129
5.2.5.2 NAC in Lösung 130
5.2.5.3 NAC als Pulver/Granulat 130
5.3 In vivo Pilotstudie: Akutes Leberversagen im Schwein 131
5.4 Diskussion der Ergebnisse 135
5.4.1 Glukonsäure im Dialysat 135
5.4.2 Konzeption einer integrierten Behandlung mit NAC in der Hämodialyse. 135
5.4.3 Oxidativer Stress bei akutem Leberversagen 138
5.4.3.1 Oxidativer Stress bei totaler Hepatektomie 138
5.4.3.2 Oxidativer Stress bei Amanitin-Vergiftung 138
5.4.3.3 Oxidativer Stress bei Ischämie/ Reperfusionsschädigung 139
5.4.3.4 Oxidativer Stress bei Paracetamol-Vergiftung 139
6. Zusammenfassung 140
; Anhang 143
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