Immunzytochemische Charakterisierung der stromalen Fraktion humanen Fettgewebes und Untersuchung des Einflusses eines Kultursystems auf der Basis von PDGF-reduziertem humanem Serum supplementiert mit bFGF und EGF auf die Differenzierungsfähigkeit und Proliferationsaktivität primärer humaner Präadipozyten:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2007
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| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | VI, 98 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
Internformat
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Datensatz im Suchindex
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|---|---|
| adam_text | Doktorarbeit Eva Köllensperger I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Die autologe Transplantation von Fettgewebe und alternative 1
Möglichkeiten zur Defektdeckung im Bereich der Gewebetechnologie
1.2 Differenzierung 4
1.3 Vorstellung der untersuchten Antigene 7
1.3.1 Adipophilin 7
1.3.2 Perilipin 8
1.3.3 Vergleich Adipophilin - Perilipin 9
1.3.4 CD31 = PECAM-1 (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1) 10
1.3.5 Von-Willebrand-Faktor 10
1.3.6 Prolyl 4-Hydroxylase 10
1.3.7 S-100 11
1.4 Vorstellung der untersuchten Wachstumsfaktoren 12
1.4.1 PDGF - platelet derived growth factor 12
1.4.2 Basischer Fibroblasten Wachstumsfaktor: bFGF - basic fibroblast 14
growth factor
1.4.3 Epidermaler Wachstumsfaktor EGF - epidermal growth factor 15
1.5 Sn-Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase (GPDH) als quantitativer 16
Marker für die adipogene Differenzierung
1.6 Fragestellung 16
2 Material und Methoden 18
2.1 Material 18
2.1.1 Geräte 18
2.1.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 18
2.1.2.1 Chemikalien 18
2.1.2.2 Verbrauchsmaterial 19
2.1.3 Medien, Medienzusätze 20
Doktorarbeit Eva Köllensperger
2.1.4 Antikörper und Detektionsagenzien 21
2.1.4.1 Antikörper 21
2.1.4.1.1 Primäre Antikörper 21
2.1.4.1.2 Sekundäre Antikörper 22
2.1.4.2 Dynabeads® 22
2.1.4.3 Detektionsagenzien und weitere Chemikalien für die 23
Immunzytochemie und Immunfluoreszenz
2.1.4.3.1 Substrate und Kern-Detektionsagenzien 23
2.1.4.3.1.1 DAB Substrat (3, 3 -Diaminobenzidin) 23
2.1.4.3.1.2 Fast Red TR/Naphthol AS-MX Alkalische Phophatase Substrat 23
Tabletten
2.1.4.3.1.3 Harris Hämalaun 24
2.1.4.3.1.4 DAPI - 4 ,6-Diarnidin-2 -phenylindol-dihydrochlorid 24
2.1.5 Puffer und Lösungen 24
2.1.5.1 Kollagenase-Puffer 24
2.1.5.2 Kollagenase-Lösung für den Verdau von präpariertem Gewebe 24
2.1.5.3 HEPES-Puffer für die Isolation von HUVEC 25
2.1.5.4 TBS (TRIS buffered saline) Trispuffer 25
2.1.5.5 PBS2 (phosphate buffered saline) 25
2.1.5.6 Mowiol4-88 25
2.1.5.7 Puffer und Lösungen für den GPDH-Test 25
2.1.5.8 Lösungen für die Proteinbestimmung nach Lowry 26
2.2 Methoden 27
2.2.1 Methoden der immunzytochemischen Charakterisierung der 27
stromalen Fraktion humanen Fettgewebes
2.2.1.1 Methoden der Zellkultur 27
2.2.1.1.1 Passage und Passagieren 27
2.2.1.2 Methoden der Zellisolation 28
2.2.1.2.1 Übersicht über die Zellisolationsmethoden 28
2.2.1.2.2 Isolation von Präadipozyten aus humanem Fettgewebe 29
Doktorarbeit Eva Köllensperger III
2.2.1.2.3 Gewinnung von Adipozyten aus humanem Fettgewebe 30
2.2.1.2.4 Isolation von Fibroblasten aus humanem Fettgewebe 30
2.2.1.2.5 Isolation von Fibroblasten aus humaner Dermis 31
2.2.1.2.6 Isolation von Endothelzellen aus humanem Fettgewebe 31
2.2.1.2.7 Isolation von HUVEC aus humaner Nabelschnur modifiziert nach 34
Jaffe
2.2.1.3 Methoden in der Immunzytochemie 35
2.2.1.3.1 Verwendung des DAKO LSAB® + Kit mit Alkalischer Phosphatase 35
2.2.1.3.2 Identifizierung von Endothelzellen durch den immunzytochemischen
36
Nachweis von von-Willebrand-Faktor
2.2.1.3.3 Immunfluoreszenz 36
2.2.1.3.4 Silanisieren von Objektträgern 37
2.2.1.3.5 Beschichten von Kulturoberflächen mit Gelatine 37
2.2.2 Methoden der Untersuchung des Einflusses eines neuen 38
Kultursystems auf der Basis PDGF-reduzierten Plasmas auf die
Differenzierungsfähigkeit und Proliferation humaner Präadipozyten
2.2.2.1 Aussaat 39
2.2.2.2 Ermittlung der Zellzahl zur Bestimmung der Verdopplungszeit 39
2.2.2.3 Differenzierung der Präadipozyten zu Adipozyten 41
2.2.2.4 Bestimmung der GPDH-Aktivität 42
2.2.2.4.1 GPDH-Messung 42
2.2.2.4.2 Bestimmung des Zellproteins 43
2.2.2.4.3 Berechnung der spezifischen GPDH-Aktivität 43
2.2.2.5 Statistische Auswertung der Daten aus den Versuchen zur 44
Bestimmung der Verdopplungszeit und der spezifischen GPDH-
Aktivität
3 Ergebnisse **
3.1 Ergebnisse der Immunzytochemie und Immunfluoreszenz 45
3.1.1 Adipophilin 45
Doktorarbeit Eva Köllensperger lv
3.1.2 Perilipin 46
3.1.3 CD 31 47
3.1.4 Von-Willebrand-Faktor 47
3.1.5 Prolyl 4-Hydroxylase 48
3.1.6 S-100 48
3.1.7 Zusammenfassung 48
3.2 Ergebnisse der Messung der Proliferationsgeschwindigkeit und der 49
spezifischen GPDH-Aktivität in einem Kultursystem auf der Basis von
PDGF-reduziertem humanem Serum
3.2.1 Ergebnisse des Vergleichs zwischen der Aufzucht mit Serum aus 49
humanem AB-Plasma und der mit humanem Serum aus thrombo-
zytenarmem Plasma bezüglich der Proliferationsgeschwindigkeit,
unter Berücksichtigung zugesetzter Wachstumsfaktoren
3.2.2 Ergebnisse der Aufzucht mit Serum aus humanem AB-Plasma 49
3.2.3 Ergebnisse der Aufzucht mit Serum aus humanem thrombo- 49
zytenarmem Plasma
3.2.4 Ergebnisse der Aufzucht mit Serum aus humanem thrombo- 51
zytenarmem Plasma supplementiert mit bFGF
3.2.5 Ergebnisse der Aufzucht mit Serum aus humanem thrombo-
zytenarmem Plasma supplementiert mit EGF
3.2.6 Zusammenfassung 52
3.2.7 Statistische Auswertung der ermittelten Zellzahlverdopplungszeit 54
3.3 Ergebnisse der Messung der Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase- 55
Aktivität
3.3.1 Ergebnisse der Aufzucht und Differenzierung mit Serum aus 55
humanem AB-Plasma
3.3.2 Ergebnisse der Aufzucht und Differenzierung mit Serum aus 56
humanem thrombozytenarmem Plasma
3.3.3 Ergebnisse der Aufzucht und Differenzierung mit Serum aus 56
humanem thrombozytenarmem Plasma supplementiert mit bFGF
Doktorarbeit Eva Köllensperger V
3.3.4 Ergebnisse der Aufzucht und Differenzierung mit Serum aus 56
humanem thrombozytenarmem Plasma supplementiert mit EGF
3.3.5 Vergleich zwischen Serum aus AB-Plasma, der Zugabe von bFGF 61
oder EGF zu SPPP und der Verwendung von SPPP ohne zusätzliche
Supplementierung von Wachstumsfaktoren im Hinblick auf die
Differenzierungsfähigkeit der Zellen (spezifische GPDH-Aktivität)
3.3.6 Statistische Auswertung der Messung der spezifischen GPDH- 61
Aktivität
4 Diskussion 62
4.1 Immunzytochemische Charakterisierung der stromalen Fraktion 62
humanen Fettgewebes
4.1.1 Adipophilin 62
4.1.2 Perilipin 65
4.1.3 CD31 66
4.1.4 Von-Willebrand-Faktor 66
4.1.5 Prolyl 4-Hydroxylase 67
4.1.6 S-100 67
4.1.7 Zusammenfassung 69
4.2 Untersuchung des Einflusses eines Kultursystems auf der Basis von 70
PDGF-reduziertem humanem Serum supplementiert mit bFGF oder
EGF auf die Differenzierungsfähigkeit und Proliferationsaktivität
primärer humaner Präadipozyten
4.2.1 Zusammenfassung 74
5 Zusammenfassung 75
6 Abbildungen 77
7 Tabellen und Grafiken 86
Doktorarbeit Eva Köllensperger
8 Abbildungsverzeichnis °
9 Literaturverzeichnis 92
10 Danksagung ^8
11 Curriculum vitae
Doktorarbeit Eva Köllensperger - 88 -
8 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Differenzierung von Präadipozyten zu Adipozyten 5
Abbildung 2 Isolation von Präadipozyten, Endothelzellen, Fibroblasten und 28
Adipozyten aus humanem Fettgewebe
Abbildung 3 Isolation von Endothelzellen mit Dynabeads® I 33
Abbildung 4 Isolation von Endothelzellen mit Dynabeads® II 33
Abbildung 5 Isolation von Endothelzellen mit Dynabeads® III 34
Abbildung 6 Aussaat für die Bestimmung der Zellzahlverdopplungszeit und 40
der spezifischen GPDH-Aktivität
Abbildung 7 Schema der Differenzierung von Präadipozyten zu Adipozyten 42
Abbildung 8 Immunfluoreszenzdarstellung von Präadipozyten, gefärbt mit 45
Anti-Adipophilin-Antikörper
Abbildung 9 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Fettgewebe 45
mit Anti-Adipophilin-Antikörper
Abbildung 10 Immunfluoreszenzdarstellung von Präadipozyten mit Anti- 46
Perilipin-Antikörper
Abbildung 11 Immunfluoreszenzdarstellung von Adipozyten mit Anti-Perilipin- 46
Antikörper
Abbildung 12 Immunfluoreszenzdarstellung von Endothelzellen aus 47
Fettgewebe mit Anti-CD31-Antikörper
Abbildung 13 Immunfluoreszenzdarstellung von HUVEC mit Anti-von- 47
Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 14 Veränderung der Verdopplungszeit bei Aufzucht mit Serum aus 50
AB-Plasma
Abbildung 15 Veränderung der Verdopplungszeit bei Aufzucht mit SPPP 50
Abbildung 16 Veränderung der Verdopplungszeit bei Aufzucht mit SPPP + 51
bFGF
Abbildung 17 Veränderung der Verdopplungszeit bei Aufzucht mit SPPP + EGF 52
Abbildung 18 Veränderung der Verdopplungszeit in Abhängigkeit von der 53
Kulturbedingung und der Passage
Doktorarbeit Eva Köllensperger - 89 -
Abbildung 19 Spezifische Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität bei 55
Aufzucht mit Serum aus AB-Plasma
Abbildung 20 Spezifische Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität bei 57
Aufzucht mit SPPP
Abbildung 21 Spezifische Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität bei 58
Aufzucht mit SPPP + bFGF
Abbildung 22 Spezifische Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität bei 59
Aufzucht mit SPPP + EGF
Abbildung 23 Spezifische Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität bei 60
verschiedenen Kulturbedingungen
Abbildung 24 Immunzytochemische Darstellung von Präadipozyten mit Anti- 77
Adipophilin-Antikörper
Abbildung 25 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus 77
Fettgewebe mit Anti-Adipophilin-Antikörper
Abbildung 26 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus Dermis 77
mit Anti-Adipophilin-Antikörper
Abbildung 27 Immunzytochemische Darstellung von Endothelzellen aus 77
Fettgewebe mit Anti-Adipophilin-Antikörper
Abbildung 28 Immunzytochemische Darstellung von HUVEC mit Anti- 78
Adipophilin-Antikörper
Abbildung 29 Immunzytochemische Darstellung von Adipozyten mit Anti- 78
Adipophilin-Antikörper
Abbildung 30 Immunfluoreszenzdarstellung von Präadipozyten mit Anti- 78
Perilipin-Antikörper
Abbildung 31 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Fettgewebe 78
mit Anti-Perilipin-Antikörper
Abbildung 32 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Dermis mit 79
Anti-Perilipin-Antikörper
Abbildung 33 Immunfluoreszenzdarstellung von Endothelzellen aus 79
Fettgewebe mit Anti-Perilipin-Antikörper
Abbildung 34 Immunfluoreszenzdarstellung von HUVEC mit Anti-Perilipin- 79
Antikörper
Doktorarbeit Eva Köllensperger - 90 -
Abbildung 35 Immunfluoreszenzdarstellung von Adipozyten mit Anti-Perilipin- 79
Antikörper
Abbildung 36 Immunfluoreszenzdarstellung von Präadipozyten mit Anti-CD31- 80
Antikörper
Abbildung 37 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Fettgewebe 80
mit Anti-CD31-Antikörper
Abbildung 38 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Dermis mit 80
Anti-CD31 -Antikörper
Abbildung 39 Immunfluoreszenzdarstellung von Endothelzellen aus 80
Fettgewebe mit Anti-CD31-Antikörper
Abbildung 40 Immunfluoreszenzdarstellung von HUVEC mit Anti-CD31- 81
Antikörper
Abbildung 41 Immunfluoreszenzdarstellung von Adipozyten mit Anti-CD31- 81
Antikörper
Abbildung 42 Immunzytochemische Darstellung von Präadipozyten mit Anti- 81
von-Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 43 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus 81
Fettgewebe mit Anti-von-Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 44 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus Dermis 82
mit Anti-von-Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 45 Immunzytochemische Darstellung von Endothelzellen aus 82
Fettgewebe mit Anti-von-Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 46 Immunzytochemische Darstellung von HUVEC mit Anti-von- 82
Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 47 Immunzytochemische Darstellung von Adipozyten mit Anti-von- 82
Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 48 Immunzytochemische Darstellung von Präadipozyten mit Anti- 83
Prolyl 4-Hydroxylase-Antikörper
Abbildung 49 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus 83
Fettgewebe mit Anti-Prolyl 4-Hydroxylase-Antikörper
Abbildung 50 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus Dermis 83
mit Anti-Prolyl 4-Hydroxylase-Antikörper
Doktorarbeit Eva Köllensperger - 91 -
Abbildung 51 Immunzytochemische Darstellung von Endothelzellen aus 83
Fettgewebe mit Anti-Prolyl 4-Hydroxylase-Antikörper
Abbildung 52 Immunzytochemische Darstellung von HUVEC mit Anti-Prolyl 4- 84
Hydroxylase-Antikörper
Abbildung 53 Immunzytochemische Darstellung von Adipozyten mit Anti-Prolyl 84
4-Hydroxylase-Antikörper
Abbildung 54 Immunfluoreszenzdarstellung von Präadipozyten mit Anti-S-100- 84
Antikörper
Abbildung 55 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Fettgewebe 84
mit Anti-S-1 OO-Antikörper
Abbildung 56 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Dermis mit 85
Anti-S-1 OO-Antikörper
Abbildung 57 Immunfluoreszenzdarstellung von Endothelzellen aus 85
Fettgewebe mit Anti-S-1 OO-Antikörper
Abbildung 58 Immunfluoreszenzdarstellung von HUVEC mit Anti-S-100- 85
Antikörper
Abbildung 59 Immunfluoreszenzdarstellung von Adipozyten mit Anti-S-100- 85
Antikörper
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| adam_txt |
Doktorarbeit Eva Köllensperger I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Die autologe Transplantation von Fettgewebe und alternative 1
Möglichkeiten zur Defektdeckung im Bereich der Gewebetechnologie
1.2 Differenzierung 4
1.3 Vorstellung der untersuchten Antigene 7
1.3.1 Adipophilin 7
1.3.2 Perilipin 8
1.3.3 Vergleich Adipophilin - Perilipin 9
1.3.4 CD31 = PECAM-1 (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1) 10
1.3.5 Von-Willebrand-Faktor 10
1.3.6 Prolyl 4-Hydroxylase 10
1.3.7 S-100 11
1.4 Vorstellung der untersuchten Wachstumsfaktoren 12
1.4.1 PDGF - platelet derived growth factor 12
1.4.2 Basischer Fibroblasten Wachstumsfaktor: bFGF - basic fibroblast 14
growth factor
1.4.3 Epidermaler Wachstumsfaktor EGF - epidermal growth factor 15
1.5 Sn-Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase (GPDH) als quantitativer 16
Marker für die adipogene Differenzierung
1.6 Fragestellung 16
2 Material und Methoden 18
2.1 Material 18
2.1.1 Geräte 18
2.1.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 18
2.1.2.1 Chemikalien 18
2.1.2.2 Verbrauchsmaterial 19
2.1.3 Medien, Medienzusätze 20
Doktorarbeit Eva Köllensperger "
2.1.4 Antikörper und Detektionsagenzien 21
2.1.4.1 Antikörper 21
2.1.4.1.1 Primäre Antikörper 21
2.1.4.1.2 Sekundäre Antikörper 22
2.1.4.2 Dynabeads® 22
2.1.4.3 Detektionsagenzien und weitere Chemikalien für die 23
Immunzytochemie und Immunfluoreszenz
2.1.4.3.1 Substrate und Kern-Detektionsagenzien 23
2.1.4.3.1.1 DAB Substrat (3, 3'-Diaminobenzidin) 23
2.1.4.3.1.2 Fast Red TR/Naphthol AS-MX Alkalische Phophatase Substrat 23
Tabletten
2.1.4.3.1.3 Harris" Hämalaun 24
2.1.4.3.1.4 DAPI - 4 ',6-Diarnidin-2'-phenylindol-dihydrochlorid 24
2.1.5 Puffer und Lösungen 24
2.1.5.1 Kollagenase-Puffer 24
2.1.5.2 Kollagenase-Lösung für den Verdau von präpariertem Gewebe 24
2.1.5.3 HEPES-Puffer für die Isolation von HUVEC 25
2.1.5.4 TBS (TRIS buffered saline) Trispuffer 25
2.1.5.5 PBS2" (phosphate buffered saline) 25
2.1.5.6 Mowiol4-88 25
2.1.5.7 Puffer und Lösungen für den GPDH-Test 25
2.1.5.8 Lösungen für die Proteinbestimmung nach Lowry 26
2.2 Methoden 27
2.2.1 Methoden der immunzytochemischen Charakterisierung der 27
stromalen Fraktion humanen Fettgewebes
2.2.1.1 Methoden der Zellkultur 27
2.2.1.1.1 Passage und Passagieren 27
2.2.1.2 Methoden der Zellisolation 28
2.2.1.2.1 Übersicht über die Zellisolationsmethoden 28
2.2.1.2.2 Isolation von Präadipozyten aus humanem Fettgewebe 29
Doktorarbeit Eva Köllensperger III
2.2.1.2.3 Gewinnung von Adipozyten aus humanem Fettgewebe 30
2.2.1.2.4 Isolation von Fibroblasten aus humanem Fettgewebe 30
2.2.1.2.5 Isolation von Fibroblasten aus humaner Dermis 31
2.2.1.2.6 Isolation von Endothelzellen aus humanem Fettgewebe 31
2.2.1.2.7 Isolation von HUVEC aus humaner Nabelschnur modifiziert nach 34
Jaffe
2.2.1.3 Methoden in der Immunzytochemie 35
2.2.1.3.1 Verwendung des DAKO LSAB® + Kit mit Alkalischer Phosphatase 35
2.2.1.3.2 Identifizierung von Endothelzellen durch den immunzytochemischen
36
Nachweis von von-Willebrand-Faktor
2.2.1.3.3 Immunfluoreszenz 36
2.2.1.3.4 Silanisieren von Objektträgern 37
2.2.1.3.5 Beschichten von Kulturoberflächen mit Gelatine 37
2.2.2 Methoden der Untersuchung des Einflusses eines neuen 38
Kultursystems auf der Basis PDGF-reduzierten Plasmas auf die
Differenzierungsfähigkeit und Proliferation humaner Präadipozyten
2.2.2.1 Aussaat 39
2.2.2.2 Ermittlung der Zellzahl zur Bestimmung der Verdopplungszeit 39
2.2.2.3 Differenzierung der Präadipozyten zu Adipozyten 41
2.2.2.4 Bestimmung der GPDH-Aktivität 42
2.2.2.4.1 GPDH-Messung 42
2.2.2.4.2 Bestimmung des Zellproteins 43
2.2.2.4.3 Berechnung der spezifischen GPDH-Aktivität 43
2.2.2.5 Statistische Auswertung der Daten aus den Versuchen zur 44
Bestimmung der Verdopplungszeit und der spezifischen GPDH-
Aktivität
3 Ergebnisse **
3.1 Ergebnisse der Immunzytochemie und Immunfluoreszenz 45
3.1.1 Adipophilin 45
Doktorarbeit Eva Köllensperger lv
3.1.2 Perilipin 46
3.1.3 CD 31 47
3.1.4 Von-Willebrand-Faktor 47
3.1.5 Prolyl 4-Hydroxylase 48
3.1.6 S-100 48
3.1.7 Zusammenfassung 48
3.2 Ergebnisse der Messung der Proliferationsgeschwindigkeit und der 49
spezifischen GPDH-Aktivität in einem Kultursystem auf der Basis von
PDGF-reduziertem humanem Serum
3.2.1 Ergebnisse des Vergleichs zwischen der Aufzucht mit Serum aus 49
humanem AB-Plasma und der mit humanem Serum aus thrombo-
zytenarmem Plasma bezüglich der Proliferationsgeschwindigkeit,
unter Berücksichtigung zugesetzter Wachstumsfaktoren
3.2.2 Ergebnisse der Aufzucht mit Serum aus humanem AB-Plasma 49
3.2.3 Ergebnisse der Aufzucht mit Serum aus humanem thrombo- 49
zytenarmem Plasma
3.2.4 Ergebnisse der Aufzucht mit Serum aus humanem thrombo- 51
zytenarmem Plasma supplementiert mit bFGF
3.2.5 Ergebnisse der Aufzucht mit Serum aus humanem thrombo-
zytenarmem Plasma supplementiert mit EGF
3.2.6 Zusammenfassung 52
3.2.7 Statistische Auswertung der ermittelten Zellzahlverdopplungszeit 54
3.3 Ergebnisse der Messung der Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase- 55
Aktivität
3.3.1 Ergebnisse der Aufzucht und Differenzierung mit Serum aus 55
humanem AB-Plasma
3.3.2 Ergebnisse der Aufzucht und Differenzierung mit Serum aus 56
humanem thrombozytenarmem Plasma
3.3.3 Ergebnisse der Aufzucht und Differenzierung mit Serum aus 56
humanem thrombozytenarmem Plasma supplementiert mit bFGF
Doktorarbeit Eva Köllensperger V
3.3.4 Ergebnisse der Aufzucht und Differenzierung mit Serum aus 56
humanem thrombozytenarmem Plasma supplementiert mit EGF
3.3.5 Vergleich zwischen Serum aus AB-Plasma, der Zugabe von bFGF 61
oder EGF zu SPPP und der Verwendung von SPPP ohne zusätzliche
Supplementierung von Wachstumsfaktoren im Hinblick auf die
Differenzierungsfähigkeit der Zellen (spezifische GPDH-Aktivität)
3.3.6 Statistische Auswertung der Messung der spezifischen GPDH- 61
Aktivität
4 Diskussion 62
4.1 Immunzytochemische Charakterisierung der stromalen Fraktion 62
humanen Fettgewebes
4.1.1 Adipophilin 62
4.1.2 Perilipin 65
4.1.3 CD31 66
4.1.4 Von-Willebrand-Faktor 66
4.1.5 Prolyl 4-Hydroxylase 67
4.1.6 S-100 67
4.1.7 Zusammenfassung 69
4.2 Untersuchung des Einflusses eines Kultursystems auf der Basis von 70
PDGF-reduziertem humanem Serum supplementiert mit bFGF oder
EGF auf die Differenzierungsfähigkeit und Proliferationsaktivität
primärer humaner Präadipozyten
4.2.1 Zusammenfassung 74
5 Zusammenfassung 75
6 Abbildungen 77
7 Tabellen und Grafiken 86
Doktorarbeit Eva Köllensperger
8 Abbildungsverzeichnis "°
9 Literaturverzeichnis 92
10 Danksagung ^8
11 Curriculum vitae "
Doktorarbeit Eva Köllensperger - 88 -
8 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Differenzierung von Präadipozyten zu Adipozyten 5
Abbildung 2 Isolation von Präadipozyten, Endothelzellen, Fibroblasten und 28
Adipozyten aus humanem Fettgewebe
Abbildung 3 Isolation von Endothelzellen mit Dynabeads® I 33
Abbildung 4 Isolation von Endothelzellen mit Dynabeads® II 33
Abbildung 5 Isolation von Endothelzellen mit Dynabeads® III 34
Abbildung 6 Aussaat für die Bestimmung der Zellzahlverdopplungszeit und 40
der spezifischen GPDH-Aktivität
Abbildung 7 Schema der Differenzierung von Präadipozyten zu Adipozyten 42
Abbildung 8 Immunfluoreszenzdarstellung von Präadipozyten, gefärbt mit 45
Anti-Adipophilin-Antikörper
Abbildung 9 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Fettgewebe 45
mit Anti-Adipophilin-Antikörper
Abbildung 10 Immunfluoreszenzdarstellung von Präadipozyten mit Anti- 46
Perilipin-Antikörper
Abbildung 11 Immunfluoreszenzdarstellung von Adipozyten mit Anti-Perilipin- 46
Antikörper
Abbildung 12 Immunfluoreszenzdarstellung von Endothelzellen aus 47
Fettgewebe mit Anti-CD31-Antikörper
Abbildung 13 Immunfluoreszenzdarstellung von HUVEC mit Anti-von- 47
Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 14 Veränderung der Verdopplungszeit bei Aufzucht mit Serum aus 50
AB-Plasma
Abbildung 15 Veränderung der Verdopplungszeit bei Aufzucht mit SPPP 50
Abbildung 16 Veränderung der Verdopplungszeit bei Aufzucht mit SPPP + 51
bFGF
Abbildung 17 Veränderung der Verdopplungszeit bei Aufzucht mit SPPP + EGF 52
Abbildung 18 Veränderung der Verdopplungszeit in Abhängigkeit von der 53
Kulturbedingung und der Passage
Doktorarbeit Eva Köllensperger - 89 -
Abbildung 19 Spezifische Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität bei 55
Aufzucht mit Serum aus AB-Plasma
Abbildung 20 Spezifische Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität bei 57
Aufzucht mit SPPP
Abbildung 21 Spezifische Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität bei 58
Aufzucht mit SPPP + bFGF
Abbildung 22 Spezifische Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität bei 59
Aufzucht mit SPPP + EGF
Abbildung 23 Spezifische Glyzerol-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität bei 60
verschiedenen Kulturbedingungen
Abbildung 24 Immunzytochemische Darstellung von Präadipozyten mit Anti- 77
Adipophilin-Antikörper
Abbildung 25 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus 77
Fettgewebe mit Anti-Adipophilin-Antikörper
Abbildung 26 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus Dermis 77
mit Anti-Adipophilin-Antikörper
Abbildung 27 Immunzytochemische Darstellung von Endothelzellen aus 77
Fettgewebe mit Anti-Adipophilin-Antikörper
Abbildung 28 Immunzytochemische Darstellung von HUVEC mit Anti- 78
Adipophilin-Antikörper
Abbildung 29 Immunzytochemische Darstellung von Adipozyten mit Anti- 78
Adipophilin-Antikörper
Abbildung 30 Immunfluoreszenzdarstellung von Präadipozyten mit Anti- 78
Perilipin-Antikörper
Abbildung 31 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Fettgewebe 78
mit Anti-Perilipin-Antikörper
Abbildung 32 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Dermis mit 79
Anti-Perilipin-Antikörper
Abbildung 33 Immunfluoreszenzdarstellung von Endothelzellen aus 79
Fettgewebe mit Anti-Perilipin-Antikörper
Abbildung 34 Immunfluoreszenzdarstellung von HUVEC mit Anti-Perilipin- 79
Antikörper
Doktorarbeit Eva Köllensperger - 90 -
Abbildung 35 Immunfluoreszenzdarstellung von Adipozyten mit Anti-Perilipin- 79
Antikörper
Abbildung 36 Immunfluoreszenzdarstellung von Präadipozyten mit Anti-CD31- 80
Antikörper
Abbildung 37 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Fettgewebe 80
mit Anti-CD31-Antikörper
Abbildung 38 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Dermis mit 80
Anti-CD31 -Antikörper
Abbildung 39 Immunfluoreszenzdarstellung von Endothelzellen aus 80
Fettgewebe mit Anti-CD31-Antikörper
Abbildung 40 Immunfluoreszenzdarstellung von HUVEC mit Anti-CD31- 81
Antikörper
Abbildung 41 Immunfluoreszenzdarstellung von Adipozyten mit Anti-CD31- 81
Antikörper
Abbildung 42 Immunzytochemische Darstellung von Präadipozyten mit Anti- 81
von-Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 43 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus 81
Fettgewebe mit Anti-von-Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 44 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus Dermis 82
mit Anti-von-Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 45 Immunzytochemische Darstellung von Endothelzellen aus 82
Fettgewebe mit Anti-von-Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 46 Immunzytochemische Darstellung von HUVEC mit Anti-von- 82
Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 47 Immunzytochemische Darstellung von Adipozyten mit Anti-von- 82
Willebrand-Faktor-Antikörper
Abbildung 48 Immunzytochemische Darstellung von Präadipozyten mit Anti- 83
Prolyl 4-Hydroxylase-Antikörper
Abbildung 49 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus 83
Fettgewebe mit Anti-Prolyl 4-Hydroxylase-Antikörper
Abbildung 50 Immunzytochemische Darstellung von Fibroblasten aus Dermis 83
mit Anti-Prolyl 4-Hydroxylase-Antikörper
Doktorarbeit Eva Köllensperger - 91 -
Abbildung 51 Immunzytochemische Darstellung von Endothelzellen aus 83
Fettgewebe mit Anti-Prolyl 4-Hydroxylase-Antikörper
Abbildung 52 Immunzytochemische Darstellung von HUVEC mit Anti-Prolyl 4- 84
Hydroxylase-Antikörper
Abbildung 53 Immunzytochemische Darstellung von Adipozyten mit Anti-Prolyl 84
4-Hydroxylase-Antikörper
Abbildung 54 Immunfluoreszenzdarstellung von Präadipozyten mit Anti-S-100- 84
Antikörper
Abbildung 55 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Fettgewebe 84
mit Anti-S-1 OO-Antikörper
Abbildung 56 Immunfluoreszenzdarstellung von Fibroblasten aus Dermis mit 85
Anti-S-1 OO-Antikörper
Abbildung 57 Immunfluoreszenzdarstellung von Endothelzellen aus 85
Fettgewebe mit Anti-S-1 OO-Antikörper
Abbildung 58 Immunfluoreszenzdarstellung von HUVEC mit Anti-S-100- 85
Antikörper
Abbildung 59 Immunfluoreszenzdarstellung von Adipozyten mit Anti-S-100- 85
Antikörper |
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