Muskelfaseranalyse und fasertypspezifische NO-Synthase-Expression in Skelettmuskeln von Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie im Vergleich zum normalen Befund:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2007
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| Beschreibung: | VI, 105, IV Bl. Ill., graph. Darst. 30 cm |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Seite
1 Einleitung und Aufgabenstellung 1
1.1 Einleitung 1
1.2 Aufgabenstellung 2
2 Theoretische Grundlagen 4
2.1 Markerenzyme zur Charakterisierung von Muskelfasereigenschaften 4
2.1.1 ATPase 4
2.1.2 Succinat-Dehydrogenase (SDH) 5
2.1.3 Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase(GPDH) 5
2.2 Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) 5
2.3 Muskelfaserklassifizierungssysteme 7
2.4 Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) 10
2.4.1 Ätiogenese muskulärer Dystrophien 10
2.4.2 Dystrophin 10
2.4.3 Ursache und Krankheitsentwicklung 11
2.4.4 Genetik 13
2.4.5 Klinische Zeichen und Verlauf 13
2.4.6 Diagnostik 14
2.4.6.1 Kreatinkinase (CK) 14
2.4.6.2 Elektromyographie und Ultraschall 15
2.4.6.3 Molekulargenetische Untersuchungen 15
2.4.6.4 Histologische, histochemische und immunhistochemische Untersuchungen 16
2.4.7 Therapie und Forschung 16
3 Material und Methoden 18
3.1 Patientencharakteristik 18
3.2 Materialgewinnung und -aufarbeitung 18
3.3 Herstellung der Kryostatschnitte 19
3.4 Laborgeräte und -materialien 20
3.5 Übersichtsfärbungen 21
3.6 Qualitative Enzymhistochemie 21
i
3.6.1 Darstellung der myofibrillären ATPase-Aktivität 22
3.6.1.1 Myofibrilläre ATPase-Aktivität nach Padykula und Herman 22
3.6.1.2 Myofibrilläre ATPase-Aktivität nach Brooke und Kaiser 23
3.6.2 SDH-Aktivität 24
3.6.3 MenadionabhängigeGPDH-Aktivität 25
3.7 Immunhistochemische Nachweisverfahren 25
3.7.1 Myosin-heavy-chain (MHC)-Nachweis 27
3.7.2 NO-Synthase-Nachweis 28
3.8 Western Blot-Analyse 29
3.9 RNA-Isolation und TaqMan-Analyse 29
3.10 Bildauswertung und Bildbearbeitung 30
3.11 Zytofotometrie - eine Methode der quantitativen Enzymhistochemie 30
3.12 Fasertypisierung 31
3.13 Statistische Analysen 33
4 Ergebnisse 34
4.1 Morphologische Veränderungen im DMD-Muskel 34
4.2 Fasertypen im Duchenne-Muskel 35
4.3 Veränderung des Fasermetabolismus im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 47
4.3.1 Veränderungen der SDH-Aktivität im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 47
4.3.2 Veränderungen der GPDH-Aktivität im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 50
4.3.3 Bestimmung und Vergleich des faserspezifischen GPDH/SDH-
Aktivitätsquotienten im DMD- und normalen Muskel 53
4.3.4 Veränderungen der ATPase-Aktivität im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 55
4.4 Altersabhängigkeit der fasertypspezifischen Enzymaktivität 56
4.5 Nachweis von NOS im DMD-Muskel 61
4.5.1 Expression und Verteilung der NOS-lsoenzyme 61
4.5.2 Klassifikation NOS-positiver Muskelfasern 63
4.6 Untersuchungen an längs angeschnittenen Muskelfasern 66
4.7 NOS-Expression in regenerierenden Fasern 70
4.8 Zytofotometrische Analyse der NOS-Expression 71
II
4.9 Western Blot und NOS-mRNA-Expression 72
5 Diskussion 75
5.1 Fasertypisierung im DMD-Muskel 75
5.2 Veränderungen des Fasermetabolismus im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 77
5.3 Altersabhängigkeit der Enzymaktivität von SDH, GPDH und ATPase im
normalen Muskel 78
5.4 Veränderungen der NOS-Expression im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 79
6 Zusammenfassung 84
7 Literaturverzeichnis 88
8 Abbildungsverzeichnis 100
9 Tabellenverzeichnis 104
10 Anhang i
10.1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit i
10.2 Tabellarischer Lebenslauf ii
10.3 Danksagung iv
III
8 Abbildungsverzeichnis
Abbildung Seite
Abb. 1 Schematische Darstellung der Synthese von Stickstoffmonoxid 6
Abb. 2 Fasertypisierung: Darstellung der Enzymaktivitäten von ATPase, SDH und
GPDH in drei repräsentativen Muskelfasern 32
Abb. 3 Morphologische Veränderungen im DMD-Muskel 34
Abb. 4 Fasertypisierung im DMD-Muskel 37
Abb. 5 Zytofotometrisch ermittelte myofibrilläre ATPase-Aktivität der 26 ausgewählten
Muskelfasern von Patient D 4 39
Abb. 6 Zytofotometrisch ermittelte SDH-Aktivität der 26 ausgewählten Muskelfasern
von Patient D 4 40
Abb. 7 Zytofotometrisch ermittelte GPDH-Aktivität der 26 ausgewählten Muskelfasern
von Patient D 4 40
Abb. 8 Fasertypspezifische ATPase-Aktivität der 26 ausgewählten Muskelfasern von
Patient D 4 41
Abb. 9 Fasertypspezifische SDH-Aktivität der 26 ausgewählten Muskelfasern von
Patient D 4 42
Abb. 10 Fasertypspezifische GPDH-Aktivität der 26 ausgewählten Muskelfasern von
Patient D 4 43
Abb. 11 Faserspezifischer GPDH/SDH-Aktivitätsquotient der 26 ausgewählten Fasern
von Patient D 4 44
100
Abb. 12 Fasertypspezifischer GPDH/SDH-Aktivitätsquotient der 26 ausgewählten
Muskelfasern von Patient D 4 45
Abb. 13 Fasertypspezifische SDH-Aktivität der Muskelfasern von N 8 - N 13 48
Abb. 14 Fasertypspezifische SDH- Aktivität der Muskelfasern von DMD-Patienten 48
Abb. 15 Vergleich der SDH-Aktivität der FOG-Fasern von DMD- und normalen
Muskeln 49
Abb. 16 Vergleich der SDH-Aktivität der SO-Fasern von DMD- und normalen
Muskeln 49
Abb. 17 Fasertypspezifische GPDH-Aktivität der Muskelfasern von N 8 - N 13 51
Abb. 18 Fasertypspezifische GPDH-Aktivität der Muskelfasern von DMD-Patienten 51
Abb. 19 Vergleich der GPDH-Aktivität der FOG-Fasern von DMD- und normalen
Muskeln 52
Abb. 20 Vergleich der GPDH-Aktivität der SO-Fasern von DMD- und normalen
Muskeln 52
Abb. 21 Vergleich der GPDH/SDH-Aktivitätsquotienten verschiedener Fasertypen
von DMD- und Normalpatienten 53
Abb. 22 Vergleich der GPDH/SDH-Aktivitätsquotienten der SO- und FOG-Fasern
von DMD- und normalen Muskeln 54
Abb. 23 Vergleich der ATPase-Aktivität verschiedener Fasertypen von DMD- und
normalen Muskeln 55
Abb. 24 Fasertypspezifische SDH-Aktivität verschiedener Patienten unterschiedlichen
Alters 57
101
Abb. 25 Fasertypspezifische GPDH-Aktivität verschiedener Patienten unterschiedlichen
Alters 58
Abb. 26 Fasertypspezifische myofibrilläre ATPase-Aktivität verschiedener Patienten
unterschiedlichen Alters 59
Abb. 27 Fasertypspezifischer GPDH/SDH-Aktivitätsquotient verschiedener Patienten
unterschiedlichen Alters 60
Abb. 28 Expression von NOS I, II, III im DMD-Muskel 62
Abb. 29 Fasertypspezifische NOS-Expression im DMD-Muskel 63
Abb. 30 NOS-Expression und Enzymaktivität der hyperkontrahierten Muskelfasern im
DMD-Muskel 65
Abb. 31 NOS-Expresion und Enzymaktivität von längs angeschnittenen Muskelfasern
im DMD-Muskel 66
Abb. 32 Immunoreaktivität für MHCslow (a) und MHC fast (b) von längs
angeschnittenen Muskelfasern im DMD-Muskel 67
Abb. 33 Segmentale Veränderungen der Querstreifung im DMD-Muskel 69
Abb. 34 NOS-lmmunoreaktivität regenerierender Muskelfasern im DMD-Muskel 70
Abb. 35 Anordnung regenerierender Muskelfasern im DMD-Muskel 70
Abb. 36 Zytofotometrisch ermittelte Aktivität von NOS I, II, III in DMD- und normalen
Muskeln 72
Abb. 37 Vergleich der mRNA-Genexpression von NOS I, II, MI in DMD- und normalen
Muskeln 73
102
Abb. 38 Western-blotting-Analyse von NOS I, II, III in Muskelbiopsien von DMD- und
normalen Patienten 73
103
9 Tabellenverzeichnis
Tabelle Seite
Tab. 1 Klassifizierung von humanen Skelettmuskelfasern 8
Tab. 2 Biometrische und klinische Daten der untersuchten Patienten 18
Tab. 3 Zuordnung der Serienschnittnummer zu den Untersuchungsmethoden 20
Tab. 4 Auflistung der verwendeten Laborgeräte 21
Tab. 5 Auflistung der für die immunhistochemischen Nachweisverfahren verwendeten
Primärantikörper 26
Tab. 6 Auflistung der für die immunhistochemischen Nachweisverfahren verwendeten
Sekundärantikörper 26
Tab. 7 Auflistung der RT-PCR-Primer und Sonden für die Amplifikation von
NOSI, II, III 30
Tab. 8 GPDH/SDH-Aktivitätsquotient verschiedener Fasertypen von Patient D 4 44
Tab. 9 Zytofotometrische Messwerte der fasertypspezifischen SDH-Aktivität von
DMD- und Normalpatienten 47
Tab. 10 Zytofotometrische Messwerte der fasertypspezifischen GPDH-Aktivität von
DMD- und Normalpatienten 50
Tab. 11 Zytofotometrische Messwerte der fasertypspezifischen ATPase-Aktivität von
DMD- und Normalpatienten 55
Tab. 12 Zytofotometrische Messwerte der fasertypspezifischen SDH- und GPDH-
Aktivität verschiedener Patienten unterschiedlichen Alters 56
104
Tab. 13 Zytofotometrische Messwerte der ATPase-Aktivität von Typ I- und Typ Il-Fasern
verschiedener Patienten unterschiedlichen Alters 59
Tab. 14 Zytofotometrische Messwerte der NOS I, II, III- Expression im DMD- und
normalen Muskel 71
105
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis
Seite
1 Einleitung und Aufgabenstellung 1
1.1 Einleitung 1
1.2 Aufgabenstellung 2
2 Theoretische Grundlagen 4
2.1 Markerenzyme zur Charakterisierung von Muskelfasereigenschaften 4
2.1.1 ATPase 4
2.1.2 Succinat-Dehydrogenase (SDH) 5
2.1.3 Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase(GPDH) 5
2.2 Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) 5
2.3 Muskelfaserklassifizierungssysteme 7
2.4 Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) 10
2.4.1 Ätiogenese muskulärer Dystrophien 10
2.4.2 Dystrophin 10
2.4.3 Ursache und Krankheitsentwicklung 11
2.4.4 Genetik 13
2.4.5 Klinische Zeichen und Verlauf 13
2.4.6 Diagnostik 14
2.4.6.1 Kreatinkinase (CK) 14
2.4.6.2 Elektromyographie und Ultraschall 15
2.4.6.3 Molekulargenetische Untersuchungen 15
2.4.6.4 Histologische, histochemische und immunhistochemische Untersuchungen 16
2.4.7 Therapie und Forschung 16
3 Material und Methoden 18
3.1 Patientencharakteristik 18
3.2 Materialgewinnung und -aufarbeitung 18
3.3 Herstellung der Kryostatschnitte 19
3.4 Laborgeräte und -materialien 20
3.5 Übersichtsfärbungen 21
3.6 Qualitative Enzymhistochemie 21
i
3.6.1 Darstellung der myofibrillären ATPase-Aktivität 22
3.6.1.1 Myofibrilläre ATPase-Aktivität nach Padykula und Herman 22
3.6.1.2 Myofibrilläre ATPase-Aktivität nach Brooke und Kaiser 23
3.6.2 SDH-Aktivität 24
3.6.3 MenadionabhängigeGPDH-Aktivität 25
3.7 Immunhistochemische Nachweisverfahren 25
3.7.1 Myosin-heavy-chain (MHC)-Nachweis 27
3.7.2 NO-Synthase-Nachweis 28
3.8 Western Blot-Analyse 29
3.9 RNA-Isolation und TaqMan-Analyse 29
3.10 Bildauswertung und Bildbearbeitung 30
3.11 Zytofotometrie - eine Methode der quantitativen Enzymhistochemie 30
3.12 Fasertypisierung 31
3.13 Statistische Analysen 33
4 Ergebnisse 34
4.1 Morphologische Veränderungen im DMD-Muskel 34
4.2 Fasertypen im Duchenne-Muskel 35
4.3 Veränderung des Fasermetabolismus im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 47
4.3.1 Veränderungen der SDH-Aktivität im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 47
4.3.2 Veränderungen der GPDH-Aktivität im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 50
4.3.3 Bestimmung und Vergleich des faserspezifischen GPDH/SDH-
Aktivitätsquotienten im DMD- und normalen Muskel 53
4.3.4 Veränderungen der ATPase-Aktivität im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 55
4.4 Altersabhängigkeit der fasertypspezifischen Enzymaktivität 56
4.5 Nachweis von NOS im DMD-Muskel 61
4.5.1 Expression und Verteilung der NOS-lsoenzyme 61
4.5.2 Klassifikation NOS-positiver Muskelfasern 63
4.6 Untersuchungen an längs angeschnittenen Muskelfasern 66
4.7 NOS-Expression in regenerierenden Fasern 70
4.8 Zytofotometrische Analyse der NOS-Expression 71
II
4.9 Western Blot und NOS-mRNA-Expression 72
5 Diskussion 75
5.1 Fasertypisierung im DMD-Muskel 75
5.2 Veränderungen des Fasermetabolismus im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 77
5.3 Altersabhängigkeit der Enzymaktivität von SDH, GPDH und ATPase im
normalen Muskel 78
5.4 Veränderungen der NOS-Expression im DMD-Muskel im Vergleich zu
normalem Muskel 79
6 Zusammenfassung 84
7 Literaturverzeichnis 88
8 Abbildungsverzeichnis 100
9 Tabellenverzeichnis 104
10 Anhang i
10.1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit i
10.2 Tabellarischer Lebenslauf ii
10.3 Danksagung iv
III
8 Abbildungsverzeichnis
Abbildung Seite
Abb. 1 Schematische Darstellung der Synthese von Stickstoffmonoxid 6
Abb. 2 Fasertypisierung: Darstellung der Enzymaktivitäten von ATPase, SDH und
GPDH in drei repräsentativen Muskelfasern 32
Abb. 3 Morphologische Veränderungen im DMD-Muskel 34
Abb. 4 Fasertypisierung im DMD-Muskel 37
Abb. 5 Zytofotometrisch ermittelte myofibrilläre ATPase-Aktivität der 26 ausgewählten
Muskelfasern von Patient D 4 39
Abb. 6 Zytofotometrisch ermittelte SDH-Aktivität der 26 ausgewählten Muskelfasern
von Patient D 4 40
Abb. 7 Zytofotometrisch ermittelte GPDH-Aktivität der 26 ausgewählten Muskelfasern
von Patient D 4 40
Abb. 8 Fasertypspezifische ATPase-Aktivität der 26 ausgewählten Muskelfasern von
Patient D 4 41
Abb. 9 Fasertypspezifische SDH-Aktivität der 26 ausgewählten Muskelfasern von
Patient D 4 42
Abb. 10 Fasertypspezifische GPDH-Aktivität der 26 ausgewählten Muskelfasern von
Patient D 4 43
Abb. 11 Faserspezifischer GPDH/SDH-Aktivitätsquotient der 26 ausgewählten Fasern
von Patient D 4 44
100
Abb. 12 Fasertypspezifischer GPDH/SDH-Aktivitätsquotient der 26 ausgewählten
Muskelfasern von Patient D 4 45
Abb. 13 Fasertypspezifische SDH-Aktivität der Muskelfasern von N 8 - N 13 48
Abb. 14 Fasertypspezifische SDH- Aktivität der Muskelfasern von DMD-Patienten 48
Abb. 15 Vergleich der SDH-Aktivität der FOG-Fasern von DMD- und normalen
Muskeln 49
Abb. 16 Vergleich der SDH-Aktivität der SO-Fasern von DMD- und normalen
Muskeln 49
Abb. 17 Fasertypspezifische GPDH-Aktivität der Muskelfasern von N 8 - N 13 51
Abb. 18 Fasertypspezifische GPDH-Aktivität der Muskelfasern von DMD-Patienten 51
Abb. 19 Vergleich der GPDH-Aktivität der FOG-Fasern von DMD- und normalen
Muskeln 52
Abb. 20 Vergleich der GPDH-Aktivität der SO-Fasern von DMD- und normalen
Muskeln 52
Abb. 21 Vergleich der GPDH/SDH-Aktivitätsquotienten verschiedener Fasertypen
von DMD- und Normalpatienten 53
Abb. 22 Vergleich der GPDH/SDH-Aktivitätsquotienten der SO- und FOG-Fasern
von DMD- und normalen Muskeln 54
Abb. 23 Vergleich der ATPase-Aktivität verschiedener Fasertypen von DMD- und
normalen Muskeln 55
Abb. 24 Fasertypspezifische SDH-Aktivität verschiedener Patienten unterschiedlichen
Alters 57
101
Abb. 25 Fasertypspezifische GPDH-Aktivität verschiedener Patienten unterschiedlichen
Alters 58
Abb. 26 Fasertypspezifische myofibrilläre ATPase-Aktivität verschiedener Patienten
unterschiedlichen Alters 59
Abb. 27 Fasertypspezifischer GPDH/SDH-Aktivitätsquotient verschiedener Patienten
unterschiedlichen Alters 60
Abb. 28 Expression von NOS I, II, III im DMD-Muskel 62
Abb. 29 Fasertypspezifische NOS-Expression im DMD-Muskel 63
Abb. 30 NOS-Expression und Enzymaktivität der hyperkontrahierten Muskelfasern im
DMD-Muskel 65
Abb. 31 NOS-Expresion und Enzymaktivität von längs angeschnittenen Muskelfasern
im DMD-Muskel 66
Abb. 32 Immunoreaktivität für MHCslow (a) und MHC fast (b) von längs
angeschnittenen Muskelfasern im DMD-Muskel 67
Abb. 33 Segmentale Veränderungen der Querstreifung im DMD-Muskel 69
Abb. 34 NOS-lmmunoreaktivität regenerierender Muskelfasern im DMD-Muskel 70
Abb. 35 Anordnung regenerierender Muskelfasern im DMD-Muskel 70
Abb. 36 Zytofotometrisch ermittelte Aktivität von NOS I, II, III in DMD- und normalen
Muskeln 72
Abb. 37 Vergleich der mRNA-Genexpression von NOS I, II, MI in DMD- und normalen
Muskeln 73
102
Abb. 38 Western-blotting-Analyse von NOS I, II, III in Muskelbiopsien von DMD- und
normalen Patienten 73
103
9 Tabellenverzeichnis
Tabelle Seite
Tab. 1 Klassifizierung von humanen Skelettmuskelfasern 8
Tab. 2 Biometrische und klinische Daten der untersuchten Patienten 18
Tab. 3 Zuordnung der Serienschnittnummer zu den Untersuchungsmethoden 20
Tab. 4 Auflistung der verwendeten Laborgeräte 21
Tab. 5 Auflistung der für die immunhistochemischen Nachweisverfahren verwendeten
Primärantikörper 26
Tab. 6 Auflistung der für die immunhistochemischen Nachweisverfahren verwendeten
Sekundärantikörper 26
Tab. 7 Auflistung der RT-PCR-Primer und Sonden für die Amplifikation von
NOSI, II, III 30
Tab. 8 GPDH/SDH-Aktivitätsquotient verschiedener Fasertypen von Patient D 4 44
Tab. 9 Zytofotometrische Messwerte der fasertypspezifischen SDH-Aktivität von
DMD- und Normalpatienten 47
Tab. 10 Zytofotometrische Messwerte der fasertypspezifischen GPDH-Aktivität von
DMD- und Normalpatienten 50
Tab. 11 Zytofotometrische Messwerte der fasertypspezifischen ATPase-Aktivität von
DMD- und Normalpatienten 55
Tab. 12 Zytofotometrische Messwerte der fasertypspezifischen SDH- und GPDH-
Aktivität verschiedener Patienten unterschiedlichen Alters 56
104
Tab. 13 Zytofotometrische Messwerte der ATPase-Aktivität von Typ I- und Typ Il-Fasern
verschiedener Patienten unterschiedlichen Alters 59
Tab. 14 Zytofotometrische Messwerte der NOS I, II, III- Expression im DMD- und
normalen Muskel 71
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